NY
中华人民共和国农业行业标准
NY/T5423-2026
奶真实性鉴定 PCR方法
Determination of the authentication ofmilkproducts-PCRmethod
中华人民共和国农业农村部 发布
前言
本文件按照GB/T1.1-2020《标准化工作导则第1部分：标准化文件的结构和起草规则》的规定起草.
请注意本文件的某些内容可能涉及专利.本文件的发布机构不承担识别专利的责任.
本文件由农业农村部畜牧兽医局提出.
本文件由全国畜牧业标准化技术委员会（SAC/TC274）归口.
本文件起草单位：中国农业科学院北京畜牧兽医研究所、农业农村部奶产品质量安全风险评估实验室（北京）、农业农村部奶及奶制品质量检验测试中心（北京）、扬州大学、中优乳奶业研究院（天津）有限公司.
本文件主要起草人：郑楠、赵圣国、苏莹莹、赵静雯、叶巧燕、刘慧敏、王加启、屈雪寅、郝欣雨、张宁、张养东.
奶真实性鉴定PCR方法
1范围
本文件描述了不同畜种奶真实性鉴定的PCR方法.
巴氏杀菌乳、高温杀菌乳、超高温灭菌乳和乳粉中的奶牛源性成分检测：多重实时荧光PCR法适用于生 本文件普通PCR法适用于特色畜种（奶牛之外的水牛、耗牛、山羊、马、驴、骆驼等其他畜种）的生乳、乳、巴氏杀菌乳、高温杀菌乳、超高温灭菌乳和乳粉中的奶牛、水牛、耗牛、山羊、绵羊、马、驴和骆驼源性成分检测.
2规范性引用文件
下列文件中的内容通过文中的规范性引用面构成本文件必不可少的条款，其中，注日期的引用文件，仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括的修改单）适用于本文件.
GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法 GB/T27403实验室质量控制规范食品分子生物学检测GB/T34796水溶液中核酸的浓度和纯度检测紫外分光光度法
3术语和定义
本文件没有需要界定的术语和定义.
4普通PCR法
4.1原理
提取试样中体细胞DNA，用特异性引物通过PCR扩增奶牛特定的DNA序列，电泳检测到大小为482bp的扩增产物，则判定试样中含有奶牛源性成分.
4.2试剂或材料
除非另有规定，仅使用分析纯试剂.
上游引物：5'-CCGATTCCCTACCCTAGTTAAT-3'： 下游引物：5'-GGATTGTGATTAAGAAGGAG-3'.
4.2.10磷酸盐缓冲液（PBS缓冲液）：称取0.27g磷酸二氢钾、1.42g磷酸氢二钠、8.0g氯化钠、0.2g氯化钾，用800ml水溶解，盐酸调节pH至7.4，加水定容至1000mL，分装后121C灭菌15min.4.2.11氯化钠溶液（0.9g/L)：称取0.90g氯化钠，用800mL水溶解，加水定容至1000mL.4.2.12乳化缓冲液，取430mL.浓度为0.9g/L氯化钠溶液 加人 聚乙二醇对异辛基苯
NY/T 5423-2026
基醚（TritonX-100），60mL95%乙醇（4.2.4），混合均匀.4.2.13三羟甲基氨基甲烷盐酸（Tris-HC1）溶液（1mol/L)：称取121.1g三羟甲基氨基甲烷（Tris），用800mL水溶解，用盐酸调节pH至8.0.加水定容至1000mL.分装后121℃灭菌15min. 4.2.14氢氧化钠溶液（10mol/L）：称取40.0g氢氧化钠，用80mL水溶解，加水定容至100mlL.4.2.15EDTA溶液（0.5mol/L）：称取186.1g二水乙二胺四乙酸二钠，加人700mL水中，在磁力搅排器上剧烈搅拌，用10mol/L氢氧化钠溶液（4.2.14）调pH至8.0，加水定容至1000mL，分装后121C灭菌15min.4.2.16溴代十六烷基三甲胺（CTAB）提取缓冲溶液：称取81.82g氯化钠、20.0g澳代十六烷基三甲1 000mL，分装后121C灭菌15min. 胺，用800mL水溶解，加人100mLTris-HCI溶液（4.2.13）和40mLEDTA溶液（4.2.15），加水定容至4.2.17Tris饱和苯酚、三氯甲烷和异戊醇混合液：V（Tris饱和苯酚）：V（三氯甲烷）：V（异戊醇）=25 24 1.4. 2.18Tris-EDTA（TE）缓冲溶液(pH 8.0)：在 800 mL 水中，依次加入 10 mLTris-HCI溶液（4.2. 13)和2mLEDTA溶液（4.2.15）.加水定容至1000mL，分装后121C灭菌15min.4.2.19引物溶液：用水或TE缓冲溶液（4.2.18）稀释引物（4.2.9）至10mol/1.4.2.2150×TAE缓冲液；称取Tris 242g于700mL水溶解，加入EDTA溶液（4.2.15)100mL、冰乙酸 4. 2. 20PCR 预混液：内含 Taq DNA 聚合酶O 05 U/pL、Mg3.0 mmol/L、dNTP 各0. 4 mmol/ L.57.1mL，充分溶解后加水定容至1000mL.4.2.236×上样缓冲液：内含EDTA30mmol/L、澳酚蓝0.05%、丙三醇36%、二甲苯蓝0.035%.4.2.24DNA提取试剂盒.4.2.25PCR产物回收试剂盒.
4.3.1天平；感量0.1 mg和0.01 g.4.3.2冷冻离心机：转速不低于12000r/min.4.3.3PCR扩增仪.4.3.4电泳仪.4.3.5凝胶成像仪.4.3.6核酸蛋白分析仪或紫外分光光度计.
4.4.2乳粉：取有代表性样品按1：8比例用水溶解，混匀后，取200mL装人洁净容器，密封并做好标 封并做好标识，0C～4C保存.识，0℃C~4℃C保存.
4.5试验步骤
4.5.1体细胞分离
（4.2.10）悬浮沉淀，转移至1.5mL离心管中，3000r/min、4℃离心10min，弃去上清液.向离心管中加 平行做2份试验.量取10mL试样，3000r/min、4C离心15min，弃去上清液，用1mLPBS缓冲液人1mLPBS缓冲液，悬浮沉淀，3000r/min、4°C离心10min，弃去上清液，加人150uL乳化缓冲液（4.2.12）及1mLPBS缓冲液，悬浮沉淀，40℃水浴10min，3000r/min、4℃离心10min，弃去上清液.加人1mLPBS缓冲液，洗涤沉淀，12000r/min、4℃离心10min，收集体细胞.
