SN 中华人民共和国出入境检验检疫行业标准 SN/T3198-2012 猪盖塔病RT-PCR检测技术规范 Quarantine protocol of RT-PCR for swine getah disease 2012-10-23发布 2013-05-01实施 中华人民共和国 发布 国家质量监督检验检疫总局 SN/T3198-2012 猪盖塔病RT-PCR检测技术规范 1范围 本标准规定了猪盖塔病的检疫规范. 本标准适用于猪盖塔病的流行病学调查和口岸检疫. 2规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的.凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文 件.凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括的修改单）适用于本文件. GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法 3缩略语 下列缩略语适用于本文件. Getah:盖塔病 4试剂与材料 4.1试剂 4.1.1电泳缓冲液TAE配制方法见附录A.1 1.0%琼脂糖凝胶板制备见附录A.2. 4.1.2人工合成的猪盖塔病病毒CAP基因片段作为阳性对照，以DEPC处理的灭菌蒸馏水作为阴性 对照. 4.1.3引物： 引物1(20pmol/uL)CAP-1:5'-cgcetcgagatgaattacattccaactcaa-3 引物2(20pmol/uL)CAP-2:5'-ctectgcagccattettetgttccftctgg-3 4.1.4RT-PCR反应试剂：PCR反应缓冲液、AMV反转录酶、RNase inhibitor酶和Taq酶、dNTPs、 MgCI、DEPC处理灭菌蒸馏水. 4.1.5电泳加样缓冲液：6 X loading buffer 4.1.6DNA相对分子质量标记：100bp~2000bp. 4.2材料 4.2.1PCR热循环仪. 4.2.2电泳仪. 4.2.3凝胶成像系统. 5操作方法 5.1样品处理 5.1.1蚊虫样品处理 取待检的蚊虫整体与用DEPC处理水配置的PBS研磨液按1：10比例混合置于研磨器中，在冰浴 1 SN/T3198—2012 中研磨，取上清液，备用. 5.1.2猪及其产品的处理 用带有抗凝剂的采血管采集待检猪的血液混匀；或将组织样品与用DEPC处理水配置的PBS研磨 液按1：10比例混合，在冰浴中研磨取上清液，备用. 5.2样品RNA的制备 5.2.1取200μL预处理的样品，加入800 HL RNA提取液TRIZOL 振荡混匀，室温放置5min. 5.2.2加入200L三氯甲烷，剧烈振摇15s 室温放置2min~3min后，12000r/min离心15min (4℃) 5.2.3吸上层水相于另一新离心管中，加入0.5mL异丙醇，充分混匀，一20℃放置15min~30min 后，12000r/min离心10min(4℃). 5.2.4弃去上清液，加75%乙醇1mL 振摇混匀，充分洗涤沉淀，7500r/min离心5min(4℃)；弃去 上清液，室温自然干燥至管壁上无水珠，溶于10μL DEPC处理水中，一70℃保存备用. 5.3RT-PCR反应体系配制 采用50L的反应体系：10XOne-step RNA PCR buffer5pL、MgCl2(25mmol/L)10uL、dNTP Mixture(各10mmol/L)5μL、RNase Inhibitor(40U/L)1pL、AMV Reverse Transcriptase XL (5U/pL)1μL、AMV-Optimized Tag(5U/L)1pL、上游引物CAP-1(20pmol/L)1p...
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