ICS65.020 B16 NY 中华人民共和国农业行业标准 NY/T2744-2015 马铃薯纺锤块茎类病毒检测 核酸斑点杂交法 Detection of potato spindle tuber viroid(PSTVd)- Nucleic acid spot hybridization(NASH) 2015-05-21发布 2015-08-01实施 中华人民共和国农业部发布 NY/T2744-2015 前言 本标准按照GB/T1.1一2009给出的规则起草. 本标准由农业部种植业管理司提出并归口. 本标准起草单位：农业部脱毒马铃薯种薯质量监督检验测试中心（哈尔滨）、中国农业科学院植物保 护研究所、黑龙江八一农垦大学. 本标准主要起草人：邱彩玲、刘尚武、张志想、吕典秋、白艳菊、李世访、王绍鹏、魏琪、董学志、耿宏 伟、万书明、金光辉、高艳玲、郭梅、闵凡祥、王亚洲、杨光辉、王晓丹、申宇、张威、范国权、张抒、宿飞飞、李 勇、胡林双、马纪、刘振宇、高云飞、杨帅、李学湛. I NY/T2744-2015 马铃薯纺锤块茎类病毒检测核酸斑点杂交法 1范围 本标准规定了马铃薯纺锤块茎类病毒(Potato Spindle Tuber Viroid PSTVd)的检测方法. 本标准适用于马铃薯的马铃薯纺锤块茎类病毒的检测. 2规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的.凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文 件.凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括的修改单）适用于本文件. GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法 GB7331马铃薯种薯产地检疫规程 GB18133马铃薯种薯 NY/T1962一2010马铃薯纺锤块茎类病毒检测 3原理 经过标记的PSTVd探针通过氢键与其互补的靶序列结合，洗去未结合的游离探针后，经放射自显 影或显色反应检测特异结合的探针，鉴定马铃薯组织是否感染PSTVd. 4试剂与材料 以下所用试剂，除特别注明者外均为分析纯试剂，水为符合GB/T6682中规定的一级水. 4.1CHC3(三氯甲烷). 4.2正电荷尼龙膜(Hybond-N). 4.3抗地高辛-AP(Anti Digoxigenin-AP). 4.4CDP-Star(化学发光法使用). 4.5X光片（化学发光法使用）. 4.6显影液、定影液（化学发光法使用）. 4.7 Tween-20(C8H14O26 聚氧乙烯去山梨醇单月桂酸酯). 4.8杂交液.市售. 4.910×阻断液.市售. 4.10提取缓冲液.在160.0mL蒸馏水中依次加入NaC111.7g、MgCl20.4g、醋酸钠(CH3 COONa) 8.21g、无水乙醇40.0mL和十二烷基磺酸钠(Sodium Dodecyl Sulfate SDS)6.0g 用HCl或NaOH 调节pH至6.0. 4.1120倍柠檬酸缓冲液储备液(20XSSC储备液).在800mL水中加人NaC1175.3g、柠檬酸钠 88.2g 加入数滴10mol/L NaOH溶液调节pH至7.0，加水定容至1L 分装后高压灭菌.或者选择市 售商品. 4.1210%SDS.在80mL水中加入SDS10g 溶解后定容至100mL. 4.132XSSC/0.1%SDS.在35.6mL蒸馏水中加入20倍柠檬酸缓冲液储备液(4.11)4mL 10% SDS(4.12)400uL 混匀. 4.140.1XSSC/0.1%SDS.在39.4mL蒸馏水中加入20倍柠檬酸缓冲液储备液(4.11)200uL 1 ...
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