ICS65.020 B16 NY 中华人民共和国农业行业标准 NY/T2257-2012 芒果细菌性黑斑病原菌 分子检测技术规范 Molecular detection for pathogen of mango bacterial black spot disease 2012-12-07发布 2013-03-01实施 中华人民共和国农业部发布 NY/T2257-2012 芒果细菌性黑斑病原菌分子检测技术规范 1范围 本标准规定了芒果细菌性黑斑病原菌[Xanthononas.campestris pv mangiferaeindicae(Patel Moniz&.Kulkami)Robbs Ribeiro&Kimura]分子检测方法. 本标准适用于芒果树叶片、枝条、果柄和果家性黑斑病原菌的定性检测. 2规范性引用文件 下列文件对于本文件自 件.凡是不注日期的引 四 注日期的版本适用于本文 可岳的修改单 SN/T1193基 3术语和定义 下列术语和 TAND MING 3.1 芒果细菌斑病” 又称芒菌 pv.mangife dico s campestris 疫性细菌病亥 害芒果的检 A.8. A.6、A.7和 3.2 一 致病性 HrpB基 及抗病植物产 和诱导非寄主 3.3 聚合酶链式屋 模板基因序列 合作用和适 计的两条引物分别与 DNA 剪 下，根据模板序列设 酶的作用下以四种脱氧核酸（ǎN 而互 合，接着在DNA聚合 然底物 一循环，使欲扩增的基因片何倍数 得以延，然后不 复变性、退火和延伸这 4原理 根据芒果细菌性黑斑病原菌过敏性反应和致病性因HpB序列特有碱基信息设计特异性引物， 对待检样品进行PCR扩增.依据是否扩增获得预期321bp的DNA片段，判断样品中是否携带芒果细 菌性黑斑病原菌. 5仪器设备及试剂 见B.1、B.2. 6取样 按附录A描述的症状仔细检查芒果树叶片、枝条、果柄和果实，发现芒果细菌性黑斑病疑似症状， 1 NY/T2257-2012 即取叶片、枝条、果柄或果实200g以上，装人牛皮纸袋中，送实验室检测. 7PCR检测 7.1PCR反应模板制备 见B.4.1. 7.2PCR反应 在PCR薄壁管中分别加入以下试剂(25L体系)后进行PCR反应：1L基因组DNA 10XPCR 缓冲液(Mg2P1us)2.5L 脱氧核糖核苷酸(dNTP)混合物2uL 特异性引物（见表1）各0.5L Tag 酶0.2L 灭菌超纯水18.3uL. 表1PCR反应的引物序列及扩增产物 引物名称 引物序列 预期扩增产物 XcmHF 5'-GGT GGT CGA ACT CGT CGG CAT-3' 321 bp XemHR 5'-GCC TGC GOC TGG ATC GGT AT-3 反应条件：95℃预变性3min 后30个循环为95℃变性30s至60s;58℃退火45s至60s;72℃延伸 1min;最后72℃延伸5min.取出PCR反应管，对反应产物进行电泳检测或4℃条件下保存，存放时间 不超过24h. 7.3反应体系中对照的设置 7.3.1阳性对照 用芒果细菌性黑斑病原菌基因组DNA作为模板. 7.3.2样品对照 用健康芒果种胚组织提取的基因组DNA作为模板. 7.3.3PCR反应体系对照 用配制反应体系的无菌超纯水代替DNA模板，检测试剂是否受到污染. 7.4PCR产物凝胶电泳检测 7.4.1凝胶制备 见B.4.2. 7.4.2加样与电泳 见B.4.3. 7.5凝胶成像分析 将整块琼脂糖凝胶置于紫外凝胶成像仪系统观察窗内，根据D...
NY/T 2257-2012 芒果细菌性黑斑病原菌分子检测技术规范.pdf
