附件4 禽用灭活疫苗中非法添加禽腺病毒群 全病毒抗原检测方法 1.适用范围 1.1本方法适用于禽用灭活疫苗中非法添加制苗用毒种的 检测. 1.2非法添加制苗用毒种的检测范围为禽腺病毒I群全病毒 抗原. 2.试验材料 2.1实验动物 SPF鸡，4~6周龄. 2.2试剂 禽腺病毒I群琼脂扩散试验抗原，阴性对照为SPF鸡血清，阳 性对照为禽腺病毒工群琼脂扩散试验阳性血清，均来源于中国兽 医药品监察所；琼脂粉或琼脂糖、氯化钠、PBS(0.01M、PH7.2). 3.检测方法 3.1免疫 用4~6周龄SPF鸡15只，其中10只鸡按制品推荐的免疫途 径和剂量进行免疫.首次免疫后14天，按照相同途径（不同部位） —16 和剂量进行第二次免疫.另取5只作为不免疫对照组.第二次免 疫后21日每只鸡分别采血，分离血清，用禽腺病毒I群琼脂扩散 试验抗原进行抗体效价测定. 3.2抗体效价测定 3.2.1琼脂板制备 称取优质琼脂粉或琼脂糖1g、氯化钠8g 加入PBS(0.01M、 pH7.2)溶液100ml中，置沸水中水浴加热融化，室温冷却至60~ 65℃后，倒入无菌平皿内（琼脂厚度约为5mm) 冷凝后加盖倒置 平皿，防止水分蒸发，隔日使用应在2~8℃保存. 3.2.2打孔 用六角形打孔器在琼脂上打孔，孔径3~4mm 孔间间距3mm. 3.2.3封底 挑出孔中琼脂后，将平皿底部至酒精灯上微微加热，使孔底琼 脂稍微融化封底. 3.2.4加样 中央孔滴加琼扩抗原50μl 第2、4孔滴加阳性对照各50μul 第 6孔滴加阴性对照50ul 第1、3、5孔滴加待检血清，每孔50μl. 3.2.5反应 将琼脂板放入湿盒中，置37℃温箱内2小时后倒置琼脂板，继 续作用至24小时，然后移至室温再放置48~72小时，观察沉 淀线. 17 3.2.6琼脂扩散试验(AGP)抗体检测结果判定 3.2.6.1试验成立条件，抗原孔与阳性对照之间出现沉淀线， 与阴性对照之间无沉淀线出现，抗体检测试验成立. 3.2.6.2当待检血清与抗原孔之间形成沉淀线，并与阳性对照 的沉淀线末端吻合，则待检血清判为阳性；当待检血清与抗原孔之 间未形成沉淀线，但阳性对照的沉淀线末端向待检血清孔内侧偏 弯，则判为弱阳性.弱阳性样品应重检一次，仍为弱阳性时可判为 阳性；当待检血清与抗原孔之间未形成沉淀线，或阳性对照与抗原 孔间的沉淀线末端向毗邻的待检血清孔直伸或向外侧偏弯时，则 判该待检血清为阴性. 4.结果判定 4.1试验成立条件，对照组鸡AGP抗体应全部为阴性，试验 成立. 4.2若待检样品免疫鸡血清1份及以上出现AGP抗体阳性， 则判定该疫苗中添加了禽腺病毒Ⅱ群全病毒抗原；若待检样品免 疫鸡血清均未出现AGP抗体阳性，则判定该疫苗中未添加禽腺病 毒I群全病毒抗原. 18- ...
农业农村部公告第717号-4-2023 禽用灭活疫苗中非法添加禽腺病毒Ⅰ群全病毒抗原检测方法.pdf
