中华人民共和国国家标准
GB/T 36812-2018
Molecular detectionmethodofPotatoyellow dwarfvirus
中国国家标准化管理委员会 国家市场监督管理总局 发布
前言
本标准按照GB/T1.1-2009给出的规则起草请注意本文件的某些内容可能涉及专利.本文件的发布机构不承担识别这些专利的责任.本标准由全国植物检疫标准化技术委员会（SAC/TC271）提出并归口.局、福建农林大学、中国检验检疫科学研究院. 本标准起草单位：中华人民共和国福建出人境检验检疫局、中华人民共和国福清出人境检验检疫
本标准主要起草人：沈建国、蔡伟、高芳盔、张永江、陈细红、李敏、王宇、吴祖建、陈寿铃.
马铃薯黄矮病毒分子生物学检测方法
1范围
本标准规定了马铃薯黄矮病毒（Potatoyellowduzrfvirux）的分子生物学检测方法.本标准适用于可能携带马铃薯黄矮病毒的植物及植物产品检疫鉴定.
2规范性引用文件
件.凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括的修改单）适用于本文件. 下列文件对于本文件的应用是必不可少的.凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文
GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法SN/T2122进出境植物及植物产品检疫抽样SN/T2964植物病毒检测规范SN/T3457植物病毒分子生物学检测规范
3马铃薯黄矮病毒基本信息
中文名：马铃薯黄矮病毒分类地位：弹状病毒科（Rhabdoviridae）、细胞核弹状病毒属（Nucieorhabdaviras）. 学名：Potato yellow duarfviras，缩写：PYDV.马铃薯黄矮病毒的其他信息参见附录A
4方法原理
马铃薯黄矮病毒的分子生物学特性是制定本检测方法的主要依据.
5仪器、用具及试剂
5.1仪器
高速冷冻离心机、电子天平、PCR仪、荧光PCR仪、水平电泳系统、一20C低温冰箱和一80C超低
温冰箱、凝胶成像分析系统、pH计、微波炉、磁力搅拌器、恒湿水浴锅、高压灭菌锅、超净工作台等.
5.2用具
体等. 可调移液器（2.5μL，10μL，20μL，100μL，200μL，1000μL）和可调移液器枪头、离心管、研
5.3试剂
除另有规定外，试剂均为分析纯，实验用水应符合GB/T6682中相关规定，RT-PCR检测试剂见附录B；实时荧光RT-PCR检测试剂见附录C.
6抽样和样品制备
6.1抽样
尽量抽取有病毒危害症状的植物材料，PYDV的危害症状描述参见附录A：抽样方法按照SN/T2122中规定执行.
6.2样品制备
分别按照有症和无症进行样品制备，具体方法按照SN/T2964和SN/T3457中规定执行.
7检测鉴定
7.1RT-PCR检测
以含PYDV材料作为阳性对照，以不含PYDV的健康植物组织作为阴性对照，同时以双蒸水代替模板作为空白对照.分别提取样品和对照的总RNA，反转录合成cDNA后进行PCR检测，具体操作见附录B，如采用商品化一步法试剂盒，则按照试剂盒说明进行.
7.2实时荧光RT-PCR检测
以含PYDV材料作为阳性对照，以不含PYDV的健康植物组织作为阴性对照，同时以双蒸水代替模板作为空白对照.分别提取样品和对照的总RNA，反转录合成cDNA后进行实时荧光PCR检测，具体操作见附录C，如采用商品化一步法试剂盒，则按照试剂盒说明进行.
8结果判定
样品检测时，检测流程及结果判定按下述原则进行：RT-PCR初步筛检，若检测结果为阴性，则判定样品不携带PYDV：若检测结果为阳性，则采用 PCR产物序列测定或实时荧光RT-PCR进行验证：若验证结果为阳性，则判定样品携带PYDV：若验证结果为阴性，则判定样品不携带PYDV.
9样品保存与结果记录
9.1样品保存
经检测确定携带PYDV的样品应保存在适合的条件下以备复核.种苗、叶片等样品保存在一80C冰箱中；做好登记和标记工作，保存期限至少1年.
9.2结果记录
片；实时荧光RT-PCR检测应有实时荧光结果图片. 记录包括样品来源、种类、检测时间、地点、方法和结果、检测人员签字.RT-PCR检测应有电泳图
附录A
（资料性附录）马铃薯黄矮病毒相关资料
A.1寄主范围
已报道的寄主包括茄科、夹竹桃科、菊科、十字花科、唇形科、豆科、菱科和玄参科植物，主要自然寄主为马铃薯（Solaxam tuberosam）.
A.2病害症状
侵染马铃薯引起病株矮缩、黄化，茎的生长点早期坏死等症状（见图A.1）.
注： 可l白 Cornell University -
图A.1PYDV侵染马铃薯引起的症状
A.3分布地区
主要分布于加拿大、美国.
A.4传播途径
主要经昆虫介体叶蝉Aceratagallia sanguinofenta、Acerafagallia sp、Agallia constricta传播，也可通过带毒种薯、块茎远距离传播.
A.5粒体形态
病毒粒体有包膜，杆菌状或子弹状，大小约380nm×75nm.
