中华人民共和国国家标准
GB/T 35942-2018
隐孢子虫套式PCR检测方法
Nested PCR method for detection of Cryptosporidium spp.
中国国家标准化管理委员会 中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局 发布
前言
本标准按照GB/T1.1-2009给出的规则起草.本标准由中华人民共和国农业部提出.本标准起草单位：中国农业科学院上海兽医研究所、中国动物卫生与流行病学中心. 本标准由全国动物卫生标准化技术委员会（SAC/TC181）归口.本标准主要起草人：陈兆国、米荣升、黄燕、刘陆世、王岩.
隐孢子虫套式PCR检测方法
1范围
本标准适用于动物的隐孢子虫感染的检测、流行病学调查和出人境检验检疫. 本标准规定了隐孢子虫套式PCR检测方法.
2规范性引用文件
件.凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括的修改单）适用于本文件. 下列文件对于本文件的应用是必不可少的.凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文
GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法
WS/T230-2002临床诊断中聚合酶链反应（PCR）技术的应用
3缩略语
下列缩略语适用于本文件.PCR：聚合酶链式反应（Polymerase Chain Reaction）.PBS：磷酸盐缓冲液（Phosphate Buffered Saline). TAE：Tris-乙酸电泳缓冲液（TrisAcetate-EDTA Buffer）EB：澳化乙锭（Ethidium Bromide).BSA:牛血清白蛋白(Bovine Serum Albumin)
4仪器、材料与试剂
4.1仪器
4.1.1PCR基因扩增仪.4.1.2高速台式冷冻离心机.4.1.3低速大容量离心机.4.1.4微量可调移液器：2μL、10μL 20μL、200μL、1 000μL 4.1.5核酸电泳仪.4.1.6核酸电泳槽.4.1.7凝胶成像分析系统.4.1.8生物样品均质研磨仪.4.1.9高压蒸汽灭菌器.
4.2材料
4.2.1一次性封口袋，4.2.2棉拭子. 4.2.3一次性PE手套.
GB/T 35942-2018
4.2.4压舌板或玻棒.4.2.5烧杯：100mL4.2.6纱布.4.2.7漏斗.4.2.8铁架台. 4.2.9 离心管 :1.5 mL 2.0 mL 15.0 mL 50.0 mL 4.2.10 200 μL PCR管.
4.3试剂
4.3.1磷酸盐缓冲液（PBS）（见附录A）.4.3.25%重铬酸钾溶液（见附录A）.4.3.31XTAE（见附录A）.4.3.410mg/mL溴化乙锭（EB）或同类核酸染料.4.3.5土壤基因组DNA提取试剂盒：市售产品. 4.3.6水：实验中配制溶液的用水应为蒸馏水或去离子水；PCR用水符合GB/T6682中一级水的规格.4.3.7DNA聚合酶：市售产品.4.3.82XPCR Buffer:市售产品4.3.1020mg/mL牛血清白蛋白（BSA). 4.3.92.5 mmol/L dNTPs(含 MgCl ):市售产品.4.3.11引物（上、下游外引物和内引物浓度分别配成100μm/mL，引物序列见附录B）.4.3.12100bpDNA分子质量标准.4.3.14质控标准卵囊：微小隐孢子虫（Cryptosoridium paroum）lowa株、贝氏隐孢子虫（C.baileyi）、 4.3.13琼脂糖（电泳级）.泰泽隐孢子虫（C.ryzzeri）、安氏隐孢子虫（C.andersoni）或其他种类的隐孢子虫卵囊，浓度为每克粪便10”个卵囊.阴性质控对照为不含隐孢子虫卵囊的去离子水或其他适宜的溶液.
5废弃物处理和防止污染的措施
废弃物处理和检验过程中防止交又污染的措施，按照WS/T230-2002中第6章-污染的预防和控制”的规定执行（见附录C）.
6样品的采集、保存和运输
6.1样品的采集
用棉拭子从禽类泄殖腔或直接从哺乳动物直肠采集粪便，或用一次性手套采集新鲜粪便约20g，装人一次性封口袋，采样过程中应戴一次性手套，采样过程中样本间避免交叉污染.每份样品标记样品编号、名称、动物来源、动物年龄、采样时间、采集单位或畜主姓名及地址.
6.2样品的保存和运输
采集的样品在2℃～8℃条件下保存应不超过72h，长期保存需加人等体积5%重铬酸钾溶液，装人灭菌容器内4℃保存.检出的阳性样品，发出报告后30d方可无害化处理.
样品运送应放在一个不透水、防泄漏的容器内，保证完全密封.将上述容器置于结实、不透水和防
泄漏的辅助包装中.冷冻剂放在辅助包装周围，使样品保持低温，确保样品在48h内送达实验室.样品应附有一份说明，包括样品提交人、样品来源地、动物种类和年龄、与动物有关的病史、测试要求以及联系方式等.
7样品的预处理
7.1穿上防护服，戴上一次性手套.将经高压灭菌或80℃~100℃烘烤20min的60目~100目铜筛网置于无菌漏斗中，放置在固定好的铁架台上，漏斗下端置于50mL离心管中，取10g待检样品（若是成形的粪便应混匀；若粪便是液体，混匀后取10mL）放人烧杯中，加30mLPBS，玻棒或压舌板混匀后经60目~100目铜筛网过滤至离心管中.
7.2滤液用移液器吸取1.5mL放人2mL离心管中，-20℃保存，用于DNA提取.
7.3剩余滤液1500g离心10min，弃上清.沉淀加人等体积5%重铬酸钾溶液，装人灭菌容器内4℃保存备用.
8操作程序
8.1DNA抽提
将保存于2mL离心管中的样品以1500g离心5min后，弃上清，沉淀用于DNA的提取，按从粪便、土壤中提取DNA的商品化试剂盒推荐的操作方法进行.
8.2套式PCR检测
8.2.1第一轮PCR扩增
按下列方法配制50μLPCR扩增反应体系：
2 × PCR Buffer(含 MgCl;) 25 μLdNTP Mixture(2.5 mmol/L) 6μLBSA(20 mg/mL) 1.5 μLP1-1(100 μmol/L) P1-2(100 μmol/ L) 1 μL 1 μLDNA聚合酶(1.0 U/μL) 1 μLDNA 模板 2 μLPCR用水 12.5 μL
循环：72C延伸7min.外引物为P1-1和P1-2（见B.1）.阳性对照模板为10个4.3.14中所列的隐孢 第一轮PCR扩增参数：94C预变性3min；94℃C变性45s.55C退火45s，72C延伸1min，35个子虫卵囊或适宜的质控隐孢子虫卵囊加人10g不含隐孢子虫卵囊的同种动物新鲜粪便，按照8.1所列方法提取的、浓度在10拷贝/μL~10拷贝/μL的隐孢子虫基因组DNA样品；阴性对照模板为10g不含隐孢子虫卵囊的同种动物新鲜粪便按8.1所列方法提取的DNA.
8.2.2第二轮PCR扩增
按下列方法配置50LPCR扩增反应体系：
2 ×PCR Buffer(含 MgCl;) 25 μLdNTP Mixture(2.5 mmol/L) 6 μLBSA(20 mig/mL) 1.5 μL
