中华人民共和国国家标准
GB/T 34777-2017
中国仓鼠卵巢（CHO)细胞表达产品 残留DNA检测荧光定量PCR法
Detection of residual DNA in biological product which expressed fromChinese hamster ovary(CHO)cell-Fluorescent quantitative polymerase chain reaction assay
中国国家标准化管理委员会 中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局 发布
前言
本标准按照GB/T1.1-2009给出的规则起草.本标准由全国生化检测标准化技术委员会（SAC/TC387）提出并归口本标准起草单位：信达生物制药（苏州）有限公司、中国测试技术研究院生物研究所.本标准主要起草人：孙左宇、周李华、李雪峰、黄晓刚、袁志军、郭燕红.
中国仓鼠卵巢（CHO）细胞表达产品 残留DNA检测荧光定量PCR法
1范围
本标准规定了检测残留宿主DNA的荧光定量PCR法.本标准适用于CHO（中国仓鼠卵巢细胞）宿主细胞系表达的生物制品的残留宿主DNA的检测.
2规范性引用文件
件.凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括的修改单）适用于本文件. 下列文件对于本文件的应用是必不可少的.凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文
GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法
3术语和定义
下列术语和定义适用于本文件.
3.1
Ct 值cycle threshold
每个反应管内荧光信号达到设定阔值时所经历的循环数.
4缩略语
下列缩略语适用于本文件.
CHO：中国仓鼠卵巢（Chinese Hamster Ovary)
5原理
物，包括正向引物：Forward Primer(5′-CCAGGCATTGGTGGCAC-3’>和反向引物：Reverse Primer (5'AGACAGGGTTTCTCTGT-3′).
采用SYBR荧光定量PCR（FQ-PCR）法，采集荧光绘制出的PCR扩增曲线C1值，与扩增体系中起始目的基因模板的对数值呈反比，以起始模板DNA对数值为纵坐标，Ct值为横坐标，制作标准曲线.
6仪器设备
6.1荧光定量PCR仅：含有SYBR荧光染料检测通道.6.2紫外-可见分光光度计：波长范围：200nm~760nm. 6.3微型离心机：转速范围：2000r/min~23000r/min
GB/T 34777-2017
6.4电热恒温水浴锅：室温至100C：温度波动范围：±0.5C：温度显示精度：0.1℃，6.5生物安全柜/超净工作台.
7试剂或材料
除非另有说明，本方法中仅使用分析纯试剂，水为GB/T6682规定的一级水.试剂盒的组成与相
关试剂的配制方式参见相应的厂家说明书.7.1基因组提取试剂盒.7.3DNA提取试剂盒. 7.2基因组纯化试剂盒.7.4引物：PCRE向引物；Forward Primer(5′-CCAGGCATTGGTGGCAC-3合成 PAGE级）;PCR反向引物：Reverse Primer（5'-AGACAGGGTTTCTCTGT-3合成PAGE级）.7.5限制性内切酶：EcoRI.7.6DNA 标准品. 7.7染料法荧光定量试剂盒.7.8蛋白酶 K(Proteinase K).7.9异丙醇（AR）.7.10无水乙醇（AR）.
8试验步骤
8.1DNA提取
8.1.1待测样品残留DNA的提取制备
用超纯水将待测样品稀释至蛋白浓度为1mg/mL~20mg/mL，取100μL稀释后的样品，参照DNA提取试剂盒的说明书，进行残留DNA的提取.
8.1.2阳性对照样品DNA的提取制备
用超纯水将待测样品稀释至蛋白浓度为1mg/mL~20mg/mL，取100pL稀释后的样品，加入20μL100pg/mL的DNA标准品，参照 DNA提取试剂盒的说明书，进行残留DNA的提取.
8.1.3阴性对照样品DNA的提取制备
用待测样品所对应的制剂缓冲液作为样品，参照8.1.1的方法进行相同倍数的稀释后，取100μL稀释后的样品，参照DNA提取试剂盒的说明书，进行残留DNA的提取.
8.2PCR扩增检测
8.2.1DNA标准品工作液的制备
0.1pg/mL等系列浓度，用于标准曲线的制备. 取 DNA 标准品 分别稀释至 100 ng/mL、10 ng/mL 、1 ng/mL、100 pg/mL10 pg/mL、1 pg/mL和
8.2.2Real-time PCR条件及体系
按表1进行反应体系的配制，各样品制备3个复孔，加样过程先将除DNA模板（即供测试的样品）以外的各组分额混合，16pL/孔，最后加人标准品/待测样品/阴性对照/阳性对照DNA9μL/孔，加好 2
后盖紧盖子，将PCR96孔板或8联管于台式离心机中瞬时离心，使混合液集中于底部.放人PCR仪的抽屉.
表1PCR扩增体系
体系组分 样品量 12 p1.Premix Ex(2×) PCR E向 引物;PCR Forward Primer(F 10 μmol/1) 1 xLPCR反向引|物：PCR Reverse Primer(R' 10 xmol/L) 1 xL超纯水（不含核糖核酸） 1 6 μLROX 参比荧光染料；R(OX Reference Dye（50×} 0 4 μxlDNA 模板（即供测试的样品） 对于不同试剂盒其扩增效率可能会有较大差异，在检测时应先确保系统适应性符合8.2.4.2的要求，必要时可调 9 yL整PCR扩增体系的样品量
8.2.3扩增条件
将制备好的PCR反应体系放人PCR仅的抽屉，按表2的反应条件进行PCR扩增.
表2PCR扩增条件
预变性 步骤1 变性 步骤2（40个循环） 退火 延伸 变性 溶解 步骤3 变性 溶解S6 95 52′℃ 72 95 ′℃ 60 ° 95 60℃30 s 1 min 1 min 1 min 15 s 1 min 30 s 15 s
8.2.4系统适应性要求
8.2.4.1有效扩增孔的取舍：根据如下检测数值的取舍标准选择有效孔：a）标准曲线上各数据点复孔，可根据标准曲线线性关系的好坏来判断是否舍去，可舍去明显影响 标准曲线相关性（使R≥0.99）的复孔数据，整条曲线上含去的复孔数不得超过3个：b）阳性对照、待测样品各复孔间检测的Ct值的SD值大于0.5时，且由此计算的DNA残留值在定量限以上，则该数据应重新检测.8.2.4.2系统适用性要求： a）扩增效率应在90%~110%；b）标准曲线的相关系数R≥0.99：c) 阳性对照样品中DNA标准品的加样回收率应在50%~150%；d）阴性对照孔无非特异性扩增（DNA含量应小于或等于1pg/mL).
8.3结果计算
8.3.1-般原则
阳性对照中DNA标准品的加样回收率为实际检测到在阳性对照中添加的DNA标准品的量，除以在阳性对照中添加的DNA标准品的理论值.阳性对照中检测到的DNA总量减去待测样品中检测得到的DNA量即为实际检测到添加的DNA标准品的量.由于各样品中提取的DNA体积固定，在计算 过程中直接用浓度表示.
