中华人民共和国国家标准
GB/T 36845-2018
Detection and identification of Spiroplasma citri Saglio et al
中国国家标准化管理委员会 国家市场监督管理总局 发布
前言
本标准按照GB/T1.1-2009给出的规则起草.
本标准由全国植物检疫标准化技术委员会（SAC/TC271）提出并归口
疫局、中华人民共和国山东出入境检验检疫局、中华人民共和国烟台出入境检验检疫局、中华人民共和 本标准负责起草单位：中华人民共和国南海出人境检验检疫局、中华人民共和国广东出人境检验检国湖南出入境检验检疫局.
本标准主要起草人：谈珺、李凯兵、刘海军、张京宣、李金庆、周慧平、刘晓红、李贺.
柑橘顽固病螺原体检疫鉴定方法
1范围
本标准规定了进境植物检疫中相橘顽固病螺原体SpiroplasmacitriSaglio etal的检疫鉴定方法.橘顽固病螺原体的检疫鉴定. 本标准适用于进出境中的葡萄柚、柠檬、橘子、橙和酸性橙等柑橘属植物种果，苗木及昆虫介体等柑
2基本信息
中文名：柑橘顽固病螺原体
学名:Spiroplasma citri Saglio et al
英文名 : Critus stubborn disease Little leaf disease of citrus Stubborn discase of citrus
英文缩写：CSD
原体目（Entomoplasmatales），螺原体科（Spiroplasmataceae)，螺原体属（Spiroplasma）. 分类地位：属植物支原体类病原，细菌域（Bacteria），柔壁菌门（Tenericutes），柔膜菌纲（Mollicutes），虫
柑橘顽固病螺原体的其他信息参见附录A.
3方法原理
根据柑橘顽固病螺原体的生物学特性、特异性引物PCR扩增及序列测定结果，荧光定量PCR检测结果确定病原物种类.
4仪器设备和主要试剂
4.1主要仪器设备
普通PCR仪、荧光PCR仪、超净工作台、灭菌锅、制冰机、核酸蛋白分析仪、高速冷冻离心机、台式小型离心机、超低湿冰箱、常规冰箱、旋涡震荡器、微量进样器、电泳仪、凝胶成像系统、显微镜.
4.2主要试剂和培养基
除另有规定外，试剂均为分析纯.PCR缓冲液、dNTPs（dATP、dTTP dCTP、dGTP）GoTagDNA聚合酶、引物和探针.
检验中用到的LD8培养基配制方法见附录D.
5检测鉴定方法
5.1症状观察
仔细观察柑橘种苗、果实、叶片等，症状描述参见附录A.
5.2病原菌的分离培养
相橘叶条洗净后用75%乙醇表面消毒5min，磨碎后的汁液接种在LD8液体培养基上，30C培养12d，显微镜观察病原物收集情况.
5.3PCR检测
PCR检测时，用从健康的植物组织DNA为阴性对照，用已鉴定的柑橘顽固病螺原体DNA为PCR扩增的模板做阳性对照，用ddHO作空白对照.
具体操作步骤见附录B.当使用商品化检测试剂盒时，参照试剂盒使用说明进行操作.
5.4序列测定
扩增片段回收后，进行克隆、测序或直接测序，测序可由生物公司完成.注：序列对比可利用 NCBI 网结上的 BLAST 软件进行，网址为=http: /
5.5实时荧光PCR检测
实时荧光PCR检测应设置对照，用从健康的植物组织DNA为PCR扩增的模板做阴性对照，用已鉴定的柑橘顽固病螺原体DNA为PCR扩增的模板做阳性对照，用ddHO作空白对照.
具体操作步骤见附录C.当使用商品化检测试剂盒时，参照试剂盒使用说明进行操作.
6结果判定
当产生以下检测结果时，则判定为检出柑橘顽固病螺原体：-5.3检测结果为阳性，面且5.4测定的序列大小与描述相符，可判定为检出柑橘顽固病螺原体： 5.5检测结果为阳性，可判定为检出相橘顽固病螺原体.
7样品保存与复核
7.1样品、菌株保存
样品经登记和经手人签字后妥善保存.对检出相橘顽固病螺原体的样品应保存于4℃冰箱中，以的菌株应及时高压灭菌处理. 备复核.从检测样品中分离并鉴定为柑橘顽固病螺原体的菌株，一80亡长期保存.对不需要长期保存
7.2结果记录与资料保存
员签字.PCR凝胶电泳检测需有电泳结果图片和实时荧光PCR扩增结果图片. 完整的实验记录包括：样品的来源、种类、检测时间、地点、方法和结果等，并要有实验人员和审核人
附录A
（资料性附录）柑桔顽固病螺原体生物学信息
A.1症状特征
该螺原体病害最典型的症状是感病的叶片通常比正常的小，呈丛状排列，叶片发生特有的斑驳：在严重的感染中，有多个芽和过多的节间，以及树的整体发育迟缓，明显矮化；受感染的树木的果实通常 是带有弯曲的柱状的，同一棵树的果实的不规则性，果实比正常小，味道可能是平淡的、酸的或苦的：种子大部分无繁殖能力，根系较正常小，有的小根呈异常颜色；非季节性开花、不平衡的水果和过早的水果掉落也是症状之一，早期症状不明显，有时有隐症现象，症状参见图A.1~图A.4.
注: J.M Bove INRA(FR摄
注： J.M Bove INRA(FR)报
图A.1种子发病症状
图A.2果实发病症状
注: J.MBove INRA(FR)摄.
注 ： J.M Bove INRA(FR)报
图A.4田间植株发病症状
图A.3田间植株发病症状
A.2寄主范围
业物种：葡萄柚（C.parisi）、柠檬（C.limon）、橘子（C.reticalata）、橙（C.sinensis）和酸性橙（C.aa 在自然条件下，只侵染柑橘属（Citrus）.易感病柑橘属的主要经济宿主包括地中海地区的主要商runtium）;其他寄主是 C.grandis 、C. limetrioides C. linonia、C.madurensis 、C.jambhiri、C.unshiu和C.paradisixrericulata（Calavan，1980）.柳杉属和种间根茎类杂种（如香茅草）也是侵染对象，在美国西南许多其他裁培的或野生植物，特别是苋科、蔡科、十字花科和卷柏属，均被侵染.
