中华人民共和国国家标准
GB/T 35342-2017
Technicalregulation formolecular detection ofBursaphelenchus xylophilus(Steiner and Buhrer)Nickle
中国国家标准化管理委员会 中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局 发布
前言
本标准按照GB/T1.1-2009给出的规则起草.本标准由全国植物检疫标准化技术委员会（SAC/TC271）提出并归口.本标准起草单位：南京林业大学、中国检验检疫科学研究院.本标准主要起草人：叶建仁、吴小芹、陈风毛、葛建军、黄麟、孙波.
引言
本文件的发布机构提请注意，声明符合本文件时，可能涉及5.1.2和5.3.2中有关松材线虫分子检测引物的相关专利的使用.
本文件的发布机构对于该专利的真实性、有效性和范围无任何立场.
该专利持有人已向本文件的发布机构保证，他愿意同任何申请人在合理且无歧视的条款和条件下，就专利授权许可进行谈判.该专利持有人的声明已在本文件的发布机构备案.相关信息可以通过以下联系方式获得：
专利持有人姓名：叶建仁
地址：南京市龙蟠路159号，南京林业大学（210037）
请注意除上述专利外，本文件的某些内容仍可能涉及专利.本文件的发布机构不承担识别这些专利的责任.
松材线虫分子检测鉴定技术规程
1范围
本标准规定了松材线虫分子检测鉴定的技术规程.
制品携带松材线虫的分子检测鉴定工作. 本标准适用于进出境植物检疫、国内植物检疫以及林业有害生物调查中松材线虫及其寄主植物和
2术语和定义
下列术语和定义适用于本文件.
2.1
松材线虫pine wood nematode[Bursa phelenchus xylophilus (Steiner et Buhrer） Nickle]
一种无脊椎动物，属于线虫门（Nematoda）、侧尾腺纲（Secernentea）、滑刃目（Aphelenchida）、滑刃总科（Aphelenchoidoidea）、滑刃科（Aphelenchoididae）、伞滑刃亚科（Bursaphelenchinae）、伞滑刃属 （Barsaphelenchus）的植物寄生线虫.
2.2
松材线虫病pine wilt disease caused by pine wood nematode
又名松树萎嘉病，是由松材线虫寄生在松树体内所引起的一种松树毁灭性森林病害.
2.3
分子检测moleculardetection
以功能基因、核糖体ITS等区域为靶标，采用分子生物学的方法在基因水平上对物种进行鉴定.2.4
寄主植物及其制品pine wood and wood products
本条箱、木托盘、本框、木桶、木轴、本樱、垫木、枕木和衬木等.经人工合成或经加热、加压等深度加工的 松材线虫寄主植物及其原木、锯材和用于承载、包装、铺垫、支撑、加固货物的木质材料，如木板箱、包装木质材料，如胶合板、纤维板等除外.
2.5
引物primer
互补的 DNA的序列. 一段短核苷酸序列.其功能是作为核苷酸聚合作用的起始点，在聚合反应时，引导合成一条与模板
2.6
TaqMan 探针TaqMan probe
发射的荧光信号被溶灭基团吸收；PCR扩增时，Tag酶的5'-3'外切酶活性将探针酶切降解，使报告荧光 一段寡核苷酸序列，两端分别标记一个报告荧光基团和一个灭荧光基团.探针完整时，报告基团基团和淬灭荧光基团分离，从面荧光监测系统可接收到荧光信号，即每扩增一条DNA链，就有一个荧光分子形成，荧光信号与扩增的拷贝数具有一一对应的关系.
2.7
循环阅值Cycle thresholdvalue
循环阔值（Ct值）的含义是指在PCR扩增过程中，荧光信号开始由本底进人指数增长阶段的拐点
GB/T 35342-2017
所对应的循环次数.Ct值是实时荧光PCR检测结果判读的依据.
2.8
聚合酶链式反应Polymerase chain reaction：PCR
在DNA聚合酶催化下，以母链DNA为模板，以特定引物为延伸起点，通过变性、退火、延伸等步特异地在体外扩增目的DNA片段. 骤，体外复制出与母链模板DNA互补的子链DNA的过程，是一项DNA体外合成放大技术，能快速
2.9
实时荧光PCRreal-timePCR
PCR反应时，加人一对特异引物与荧光探针，利用荧光信号的变化实时检测PCR扩增反应中每个循环扩增产物量的变化，通过对Ct值和标准曲线的分析从而对起始模板进行定量分析.
2.10
交叉引物恒温扩增技术crossingprimingamplification：CPA
一种新的核酸恒温扩增技术.针对目的基因设计特异性引物（包括扩增引物和交叉引物），利用具有链置换功能的BxDNA聚合酶，在等温条件下高效、快速、高特异地扩增靶序列.
2.11
反应体系reactionvolumes
一个PCR反应的总体积（gL）以及所包含的各种反应成分的浓度.包含10×扩增缓冲液、4种dNTP混合物、引物、模板DNA、TaqDNA聚合酶、Mg、双蒸水等，实时荧光定量PCR还包含探针的浓度.
2.12
反应程序reaction Procedures
延伸等各个反应步骤需要的温度以及在该温度条件下所持续的时间，还包含循环的数量.
2.13
特征条带characterizedband
采用分子检测技术对物种进行检测鉴定时，因所用引物为该物种特异性引物而扩增出的物种特有的DNA片段.
2.14
阳性对照positive control
试验的一个控制处理，用于检验试验本身的正确与否.即在用分子生物学技术手段对物种进行检测鉴定时，一个试验处理的模板为该物种的DNA.
2.15
阴性对照negative control
试验的一个控制处理，用于检验试验本身的正确与否.即在用分子生物学技术手段对物种进行检测鉴定时，一个试验处理的模板用无菌水替代.
2.16
结果判读results judgement
有特征条带，实时荧光PCR检测方法的判读是根据反应结束后Cr值的有无以及大小综合判别. 对分子检测方法所获得结果的判断.交叉引物恒温扩增检测方法的判读依据是扩增产物中是否含
3检测签定对象
疑似松材线虫，或疑似带有松材线虫及其传插媒介昆虫活体的寄主植物（参见附录A）及其制品.
