中华人民共和国国家标准
转基因植物及其产品成分检测 耐除草剂大豆WYN029GmA转化 体特异性PCR方法
Detection of genetically modified plants and derived productsEvent-specificPCRmethod for herbicide-tolerantsoybeanWYN029GmA
中华人民共和国农业农村部 吊发布
前言
本文件按照GB/T1.1-2020《标准化工作导则第1部分：标准化文件的结构和起草规则》的规定起草.
请注意本文件的某些内容可能涉及专利.本文件的发布机构不承担识别专利的责任.
本文件由中华人民共和国农业农村部提出.
本文件由全国农业转基因生物安全管理标准化技术委员会归口.
本文件起草单位：农业农村部科技发展中心、浙江新安化工集团股份有限公司.
傅芳奇、江晓丹、王丹、裴欣瑶、王颗潜、陈红. 本文件主要起草人：蒋红叶、何军光、苗是婷、王晨尧、李佳岢、周骏、张凌燕、李静静、廖一尘、张月秋.
转基因植物及其产品成分检测
耐除草剂大豆WYN029GmA转化体特异性PCR方法
1范围
本文件规定了耐除草剂大豆WYN029GmA转化体特异性PCR定性和定量检测方法. 本文件适用于大豆及制品中WYN029GmA转化体成分的定性和定量检测.
2规范性引用文件
下列文件中的内容通过文中的规范性引用面构成本文件必不可少的条款.其中，注日期的引用文件，文件.
NY/T672转基因植物及其产品检测通用要求
农业部2031号公告一8-2013转基因植物及其产品成分检测大豆内标准基因定性PCR方法
3术语和定义
农业部2031号公告一8一2013界定的以及下列术语和定义适用于本文件.
3. 1
WYN029GmA 耐除草剂大豆WYN029GmA转化体特异性序列event-specific sequence ofherbicide-tolerant soybean
耐除草剂大豆WYN029GmA转化体的外源插人片段5'端或（和）3'端与大豆基因组的连接区序列，包括大豆基因组部分序列及转化载体T-DNA部分序列.
3.2
阳性质控品positive control
用于质量控制的阳性样品，分为用于定性检测的阳性定性质控品和用于定量检测的阳性定量质控品.注：阳性质控品宜优先选用有证标准物质，也可使用经验证的实验室配制样品.阳性定性质控品的转基因含量为0.1%~1.0%，期性定量质控品的转基因含量宜与标识阔值相当.
3.3
校准品calibrator
或阳性样品的DNA稀释制备，确认后至少含5个有效浓度.宜优先选用有证标准物质. 用于绘制标准曲线的梯度稀释样品，用纯合转化体基因组DNA或转基因含量较高的有证标准物质
3.4
子样subsample
试样预处理后，从同一试样不同位置随机抽取的独立样品，
△C值△Crvalue
AACr值AACt value
实时荧光PCR扩增中试样的△C值与阳性定量质控品的△C值的差值.
4通用要求
4.1检测方法
法（方法一）、实时荧光PCR定量检测方法（方法二）、普通PCR定性检测方法（方法三）3种方法，可根据 第5章至第7章分别规定了耐除草剂大豆WYN029GmA转化体成分的实时荧光PCR定性检测方实际检测需求选用.
4.2试剂、材料、模板
第5章至第7章规定的3种不同方法间的试剂、材料、试样模板、质控品模板，在满足检测条件的情况下可以通用.
5实时荧光PCR定性检测方法（方法一）
5.1原理
采用规定的引物和探针对试样中大豆内标准基因和耐除草剂大豆WYN029GmA转化体特异性序列，进行实时荧光PCR扩增.依据是否扩增获得预期的典型扩增曲线，判断试样中是否含有耐除草剂大 豆WYN029GmA转化体成分.若试样中含有耐除草剂大豆WYN029GmA转化体成分，计算试样与阳性定量质控品的△△C值，判定试样与阳性定量质控品相比转化体成分含量的高低.
5.2试剂和材料
除非另有说明，仅使用分析纯试剂、蒸馏水或以上等级的水.5.2.1DNA提取试剂盒.5.2.2PCR扩增试剂：Tag DNA聚合酶、PCR扩增缓冲液、25mmol/1氯化镁（MgCl）溶液、dNTPs溶 液（浓度为10mmol/L的dATP、dTTP、dGTP、dCTP4种脱氧核糖核苷酸溶液等体积混合）.注：若不采用上述PCR扩增试剂，也可选用实时获光PCR试剂盒，
5.2.3大豆内标准基因Lecrin基因引物/探针
Iee-1215F;5′-GCCCTCTACTCCACCCCCA-3′;Iee-1269P:5'-AGCTTCGCCGCTTCCTTCAACTTCAC-3'. lee-1332R:5′-GCCCATCTGCAAGCCTTTTT-3′;注1：预期扩增片段大小为118bp.注2;lee-1269P 为Lertin基因的 TaqMan 探针，其5编标记荧光报告基团（如 FAMHEX 等）.3编标记对应的茨光摔[来源：农业部2031号公告-8-2013，5 13] 灭基闭(如 TAMRA、BHQ1等）
5.2.4耐除草剂大豆WYN029GmA转化体特异性序列引物/探针
注2：WYN029GmA-qP为耐除草剂大豆WYN029GmA转化体特异性序列的TaqMan探针.其5端标记荧光报告基团（如FAM、HEX等）3编标记对应的荧光等灭基团（如TAMRA、BHQ1等）
5.2.510mol/L氢氧化钠（NaOH）溶液：在160ml水中加人80.0g氢氧化钠，溶解后，冷却至室湿，再加水定容至200mL.
5.2.6500mmol/1乙二胺四乙酸二钠（EDTA-Na-）溶液（pH8.0）：称取18.6g乙二胺四乙酸二钠，加人70mL水中，缓慢滴加氢氧化钠溶液（见5.2.5）直至乙二胺四乙酸二钠完全溶解，用氢氧化钠溶液（见5.2.5）调pH至8 0，加水定容至100mL.在103.4kPa（121℃C）条件下灭菌20min，
5.2.71mol/L三羟甲基氨基甲烷-盐酸（Tris-HC1）溶液（pH8.0)：称取121.1g三羟甲基氨基甲烷溶解于800 mL水中-用盐酸（HC1）调pH至8 0.加水定容至1 000 mL.在103.4 kPa（121 C）条件下灭菌 20 min.2
