中华人民共和国国家标准
GB/T 36844-2018
Detection and identification of Pseudomonas syringae pv.maculicola(McCulloch)Youngetal.
中国国家标准化管理委员会 国家市场监督管理总局 发布
前言
本标准按照GB1.1-2009给出的规则起草.请注意本文件的某些内容可能涉及专利.本文件的发布机构不承担识别这些专利的责任.本标准由全国植物检疫标准化技术委员会（SAC/TC271）提出并归口. 本标准主要起草单位：中华人民共和国湖南出人境检验检疫局、中华人民共和国上海出人境检验检疫局.
本标准主要起草人：唐连飞、周慧平、莫瑾、易建平、朱金国、黄迎波、谭建锡.
十字花科细菌性黑斑病菌检疫鉴定方法
1范围
本标准规定了十字花科细菌性黑斑病菌的检疫鉴定方法.本标准适用于十字花科蔬菜及其种子等植物材料中细菌性黑斑病菌的检疫鉴定.
2规范性引用文件
件.凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括的修改单）适用于本文件. 下列文件对于本文件的应用是必不可少的.凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文
GB/T3543.2农作物种子检验规程扦样GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法SN/T2122进出境植物及植物产品检疫抽样方法
3十字花科细菌性黑斑病菌基本信息
中文名：十字花科细菌性黑斑病菌学名:Psendoonas syringae pv. macalicola (MeCulloch) Young et al. 英文名：crucifer bacterial black spot分类地位：十字花科细菌性黑斑病菌属假单胞菌科（Pseudomonaceae），假单胞菌属（Pseudomonas），丁香假单胞菌（Psradomonax syringae），斑点致病变种.其他信息参见附录A.
4方法原理
根据发病特征、病菌生物学和生理生化特性、分子生物学技术以及致病性等进行检疫鉴定.
5仪器和用具
生物显微镜、恒温培养箱、电子天平（千分之一）、植物恒温光照培养箱、冰箱、离心机、超净工作台、PCR扩增仪、实时荧光定量PCR仪、可调移液器等.
6试剂和培养基
6.1试剂
除另有规定外试剂均为分析纯或生化试剂.
6.2培养基
见附录B.
7检疫签定方法
7.1现场检疫
叶片出现近圆形或不规则形病斑，直径1mm~5mm，初期水浸状，后期呈褐色至黑色，边缘较深；叶脉病变呈褐色水浸状等症状（参见附录A）.
对现场发现上述类似症状的植株进行取样，进行实验室分离鉴定.取样方法见SN/T2122.
蔬菜种子取样进行实验室分离鉴定，取样方法见GB/T3543.2.
7.2病原菌分离
实验室用水满足GB/T6682要求.
选择较新鲜的发病组织，切取病健交界部位，用无菌水冲洗掉泥沙后置75%乙醇中浸泡2min，用无菌水清洗3次.在灭菌研中研碎，加儿滴灭菌生理盐水浸泡15min～20min.用接种环巍取划线接种于营养琼脂（NA）平板，接种3个以上.
酸钠表面消毒10min，灭菌水洗3次，加人100mL生理盐水，4C浸泡过夜；4层纱布过滤，滤液 从种子检测样品中随机抽取50g种子灭菌水洗3次后加人灭菌水100mL浸泡0.5h；0.5%次氯10000r/min离心15min，1mL灭菌水悬浮沉淀：沉淀悬浮液10倍系列稀释，分别取10倍、100倍和1 000倍各100μL用于金氏B（KB)平板涂布分离，每个稀释度涂布10个平Ⅲ.
将接种平板置26℃±1C培养3d~4d，观察在平面上菌落光滑有光泽，白色至灰白色，边缘初圆形光滑，质地均匀，后具皱褶紫外线（254nm）照射产生黄绿色荧光，选取产生扩散性荧光的菌落用 NA纯化培养做进一步鉴定.
7.3生化鉴定
7.3.1LOPAT试验
蔗糖形成果聚糖、氧化酶反应、马铃薯软腐试验、精氨酸双水解反应和烟草过敏反应，按附录B进行.
LOPAT试验结果为：蔗糖形成果聚糖试验（）、氧化酶反应（一）、马铃薯软腐试验（一）、精氨酸双水解反应（一）、烟草过敏反应（十）.
7.3.2GATTa 试验
明胶液化试验、七叶苷水解试验、酪氨酸酶活性试验、利用酒石酸盐试验，按附录B进行.
GATTa的试验结果为：明胶液化试验（一或缓慢）、七叶苷水解试验（十）、酪氨酸酶活性试验（-）、利用酒石酸盐试验（十）.
7.3.3Biolog微生物签定方法
也可采用Biolog生化鉴定方法进行鉴定.
7.4PCR检测
7.4.1常规定性PCR
从分离培养的细菌菌株中提取DNA作为模板，进行PCR检测和电泳分析.检测步骤和条件见附录C，用十字花科细菌性黑斑病菌标准菌株基因组DNA作为阳性对照，用不含有十字花科细菌性黑斑病菌的十字花科组织或种子基因组DNA为阴性对照，用双蒸水作空白对照，进行PCR扩增，将扩增产 2
物进行琼脂糖电泳分析.待测样品扩增产物的电泳结果与阳性对照一致，阴性对照和空白对照未出现条带，则判断为阳性，未出现与阳性对照一致的条带则判断为阴性.
7.4.2实时荧光定性PCR
以分离培养的细菌菌株中提取DNA作为模板，进行实时荧光PCR检测.检测步骤和条件见附录在阳性对照、阴性对照和空白对照均成立的情况下，样品出现阳性信号则判断为阳性，未出现阳性信号则判断为阴性.
7.5致病性检测
必要时，可进行致病性测定.
将纯化的菌株在KB平板培养生长24h～48h后，用无菌牙签挑菌接种于KB液体培养基中26C士1C，220r/min摇菌培养12h~24h，离心收集沉淀，再用无菌水将菌体沉淀配成 1×10CFU/mL~1X10CFU/mL的菌悬液，采用针剩接种分离物分别接种油菜、花椰菜和番茄幼苗叶片，种后放置于28C光照培养箱中90%的湿度条件下培养7d后观察是否有症状产生.接种油菜后，油莱叶片初期产生针尖大小斑点，后变为褐色坏死状病斑，病斑周围伴随着大量黄绿色晕圈，后期病斑融合成不规则的大坏死斑.接种花椰菜叶片7d后，叶片产生针尖大小的黑褐色小斑点，斑点周围伴随椰菜明显，斑点周围也伴随黄绿色晕阉（参见附录D）.从接种发病的油菜、花椰莱和番茄幼苗叶片重新 黄绿色晕圈.接种番茄叶片后，7d后观察叶片也产生黑褐色斑点，但斑点直径较大，症状较油菜和花分离病菌，均可得到与接种物同样的分离物.
8结果判定
8.1分离的菌株符合7.2特征，生化特征符合7.3.1和7.3.2或符合7.3.3，且7.5致病性阳性时，判为检出十字花科细菌性黑斑病菌.否则判定为未检出十字花科细菌性黑斑病菌.
8.2分离的菌株符合7.2特征常规PCR检测结果为阳性且7.5致病性阳性时判为检出十字花科细菌性黑斑病菌：分离的菌株符合7.2特征，荧光PCR检测结果阳性时，判为检出十字花科细菌性黑斑病 菌.否则判定为未检出十字花科细菌性黑斑病菌.
9样品保存
经高压灭菌后方可处理. 检出十字花科细菌性黑斑病菌的样品经登记和经手人签字后妥善保存6个月以上.保存期满后应
10菌种保存
签字后置于4℃冰箱中保存，30d转接一次.也可将菌株冻干保存. 分离并最终鉴定为十字花科细菌性黑斑病菌的菌株转接到NA培养基试管斜面上登记和经手人
