中华人民共和国国家标准
GB/T 36433-2018
纺织品 山羊绒和绵羊毛的 混合物DNA定量分析 荧光PCR法
Textiles-DNA quantitative analysis of cashmere and wool mixture-FluorescencePCRmethod
中国国家标准化管理委员会 国家市场监督管理总局 发布
前言
本标准按照GB/T1.1-2009给出的规则起草本标准由中国纺织工业联合会提出.本标准由全国纺织品标准化技术委员会（SAC/TC209）归口. 本标准起草单位：上海出入境检验检疫局、中纺标检验认证股份有限公司.本标准主要起草人：费静、谢璐蔓、隋阳华、斯颖、唐墩峰、陆维民.
纺织品山羊绒和绵羊毛的 混合物DNA定量分析荧光PCR法
1范围
本标准规定了采用荧光PCR法测定纺织品中山羊绒、绵羊毛的DNA定量检测方法.本标准适用于纺织品混合物中两组分山羊绒、绵羊毛含量的检测. 本标准不适用于回用、剥色的山羊绒和绵羊毛纤维，以及安哥拉山羊毛.
2规范性引用文件
件.凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括的修改单）适用于本文件. 下列文件对于本文件的应用是必不可少的.凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文
GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法GB/T19495.1转基因产品检测通用要求和定义GB/T19495.2转基因产品检测实验室技术要求
3术语和定义
下列术语和定义适用于本文件.
3.1
聚合酶链式反应polymerase chain reaction：PCR
在DNA聚合酶催化下，以母链DNA为模板，以特定引物为延伸起点，以4种单核苷酸（dNTP）为底物，通过变性、退火、延伸的循环反应，使极少量的DNA的特定片段，在数小时内扩增出百万倍的DNA的体外扩增链式反应.
3.2
实时荧光定量PCRreal-timefluorescence PCR
在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号积累实时监测整个PCR进程，再通过曲线对未知模板进行定量或定性分析的DNA扩增方法.
3.3
引物primer
在核酸合成反应时，作为每个多核苷酸链进行延伸的出发点并起作用的一小段单链DNA或RNA
3.4
TaqMan 探针TaqMan probe
一种荧光基团连接在探针的5末端，而淳灭基团则在3末端的寡核苷酸链.
注：PCR扩增时在加入一对引物的同时加人一个特异性的荧光探针，探针完整时，报告基团发射的荧光信号被停灭基团吸收：PCR扩增时，Taqg酶的5'-3外切酶活性将探针酶切降解使报告荧光基团和湾灭荧光基团分离，从面荧光监测系统可接收到荧光信号，即每扩增一条DNA链，就有一个荧光分子形成，实现了荧光信号的累积与
PCR产物形成完全同步.
3.5
Ct值cyele threshold
每个反应管内的荧光信号达到设定的闺值时所经历的循环数.
4原理
针对山羊、绵羊的线粒体DNA序列设计物种特异的引物和探针，利用实时荧光PCR技术，建立起山羊绒、绵羊毛混合物与它们的DNA之间的对应关系.通过对混合纤维抽提出的DNA中的山羊成分、绵羊成分进行特异性扩增，根据得到的Ct值，计算该样品中山羊绒、绵羊毛的相对含量.
5试剂
5.1蛋白酶K溶液：称取180mg的蛋白酶（>30U/mg），溶于10mL水中，分装后置于-20℃C冻存. 除非另有说明，在分析中仅使用分析纯试剂，水应符合GB/T6682一级水要求.5.2二硫苏糖醇（DTT）溶液：称取1.5gDTT溶于10mL水中，分装后置于-20“C冻存.5.3十六烷基三甲基澳化铵（CTAB）：纯度>98%.5.4乙二胺四乙酸（EDTA)：纯度>98%，5.5氯化钠. 5.6氢氧化钠.5.7三羟甲基氨基甲烷（Tris-HC1）：纯度>98%，5.8苯酚.5.1070%冰乙醇（体积分数）：一20C冷藏. 5.9三氧甲烷.5.11石油醚.5.12CTAB 裂解液（pH=8.0)：含有2%CTAB（质量体积比，g/L);0.1 mol/L tris-HC1:20 mmol/LEDTA;1.4 mol/L NaC1 5.132×TaqMan荧光定量预混液（2XTagMan universal Master Mix）：4C保存，或其他等效产品. 警告：2×TaqManuniversal MasterMix对眼睛和呼吸道有轻微刺激，使用时应采取完善的保护
5.14引物、探针序列信息：见表1.
6仪器和器具
6.1冰箱：-20C~4℃C.6.2天平：分度值0.001g.6.3空气浴振荡仪：能控制温度56C士2℃，6.4冷冻离心机：-20℃~40℃. 6.5误旋仪.6.6微量移液器及吸头：0.2μL~2μL、1μL~10μL、2μL~20pL、20μL~200pL、200μL~1 000 μL.6.7离心管：1.5mL.2.0mL 6.8实时荧光PCR光学反应管或光学96孔板.2
6.9实时荧光定量PCR仪.6.10索氏抽提装置.6.11液氮冷冻研磨仪.
7取样和试样的预处理
7.1取样
按照GB/T16988规定取样品，使其具有代表性，并足以提供全部所需试样，每个试样至少两份，每份试样不少于0.2g.
7.2试样的预处理
对于经不溶性浆料、树脂等处理过的样品，如果需要可按以下方法进行预处理.
石油醚挥发后，把试样浸入冷水中，浸泡1h，再在65℃土5C水中浸泡1h，浴比为100：1，时时搅拌，然后抽吸或离心脱水、晾干，如试样上的水不溶性浆料、树脂等非纤维物质不能用石油醚和水萃取掉，则要用对纤维组成没有影响的特殊方法处理.
8试验条件
试验条件满足GB/T19495.1和GB/T19495.2的规定.
9试验步骤
9.1标准曲线的建立
使用直径相近的100%山羊洗净绒、100%绵羊洗净毛自制标准混合样.分别称取羊绒含量为10%、30%、50%、70%、90%，总质量为0.5g山羊绒、绵羊毛混合物，将它们用液氮冷冻研磨仪（6.11）粉碎，用以提取DNA.按9.2和9.3中所述试验步进行操作.
对仪器采集到的针对每个标准混合物的C1值，求得C1-C两者的差值△C为横坐标，以g（1/9）、Ig（3/7）、lg（5/5）、lg（7/3）、lg（9/1）的值为纵坐标，进行曲线拟合，建立线性的羊绒羊毛定量标准曲线.参见附录A标准曲线建立的示例.
9.2DNA的抽提
9.2.1将所取试样（7.1）用剪刀尽量剪碎至纤维长度0.2mm以下，也可使用液氮冷冻研磨仪（6.11）进行研磨.
9.2.2称取试样30mg，并将其置于2mL的离心管，使用微量移液器（6.6）加人0.9mLCTAB裂解液（9）（）0（）0（）
9.2.3将离心管置于56C空气浴振荡仪（6.3），以500r/min的速度振荡过夜（至少8h）.
9.2.4取出反应完成后的离心管，将其置于离心机（6.4）以10000r/min室湿离心3min后，取上清液900pL移置另一个新的离心管.加人450μL苯酚，剧烈振荡.再加人450μL氯仿，将混合液上下剧烈候例20 s.
9.2.5将离心管于室温离心，10000r/min，10min，取800μL的上清液至新的离心管.
9.2.6重复9.2.4（苯酚400pL，氯仿400μL）和9.2.5，最后吸取750μL上清液至新的离心管.
