中华人民共和国国家标准
GB/T35917-2018
常见动物源性成分快速测定 膜芯片法
Rapid detection for animal-derived materials-Membrane-based array method
中国国家标准化管理委员会 中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局 发布
前言
本标准按照GB/T1.1-2009给出的规则起草.
本标准由中国标准化研究院提出并归口.
本标准起草单位：中国标准化研究院、四川华汉三创生物科技有限公司、山东省食品药品检验研究院、安徽省食品药品检验研究院、安徽出人境检验检疫局、滨州市食品药品检验检测中心、成都市食品药 品检验研究院、江西省食品药品检验研究院、上海市兽药饲料检测所.
本标准主要起草人：云振字、李文静、霍胜楠、吴琦、王骏、赵琳、程满、宗凯、马晓蕾、祝建华、李云飞、余晓峰、安虹、梁恒兴、张彪、吴鑫、商军、丁卫平、韩家忠、曾莲、刘菲、张红光、黄广平.
常见动物源性成分快速测定膜芯片法
1范围
本标准规定了常见动物源性成分膜芯片检测方法的原理、试剂与仪器设备、样品制备与保存、试验步骤、生物安全措施、结果判定、结果表述.
本标准适用于肉制品及饲料中猪、黄牛、羊、鸡、兔、驴、貂、孤、鼠、耗牛、鸭共11种常见动物源性成分的快速定性检测.
本标准规定的动物源性成分检出限为0.1%（质量分数）.
2规范性引用文件
下列文件对于本文件的应用是必不可少的.凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件.凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括的修改单）适用于本文件.
GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法 GB/T9695.19肉与肉制品取样方法GB/T14699.1饲料采样GB/T20195动物饲料试样的制备GB/T27403实验室质量控制规范食品分子生物学检测
3术语、定义和缩略语
3.1术语和定义
下列术语和定义适用于本文件.
3. 1.1
聚合酶链式反应polymerase chain reaction：PCR
在DNA聚合酶催化下，以母链DNA为模板，以特定引物为延伸起点，通过变性、退火、延伸等步骤，体外复制出与母链模板DNA互补的子链DNA的过程.
3.1.2
多重聚合酶链式反应multiplexPCR
在同一PCR反应体系中加入两对以上引物，同时扩增出多个核酸片段的PCR反应.
3.2缩略语
下列缩略语适用于本文件.ATPase 6:ATP 合成醇亚基 6(ATP synthase 6) AminolinkerC6：6个碳原子作为连接臂的氨基标记（C6Aminolinker）bp:碱基对（base pair)cox1:线粒体细胞色素氧化酶亚基I基因（Cytochrome coxidase subunitI）cyrb：线粒体细胞色素b基因（Cytochrome b）DNA：脱氧核糖核酸（Deoxyribonucleic acid)
D-loop:线粒体 DNA控制区（Control region displacement loop)dATP：脱氧腺苷三磷酸（Deoxyadenosine triphosphate）dCTP：脱氧胞苷三磷酸（Deoxycytidine triphosphate）dGTP：脱氧鸟甘三磷酸（Deoxyguanosine triphosphate)dUTP:脱氧尿苷三磷酸（Deoxyuridine triphosphate） dTTP:脱氧胸苷三磷酸（Deoxythymidine triphosphate)NC：阴性对照（Negative control)PC：阳性对照(Positive control)Taq 酵：Taq DNA 聚合酶（Taq DNA polymerase)UNG 酶：尿嘧啶-N-糖基化酵（Uracil N-glycosylase) 18S rRNA 基因：编码 18S 核糖体 RNA 基因(18S ribosomal RNA gene)
4原理
针对肉制品及饲料中常见动物源性成分特异性基因片段设计引物，对DNA模板进行多重聚合酶链式反应扩增，扩增产物与固定有目标基因特异性探针的膜芯片进行杂交，经化学显色后可在杂交点上形成肉眼可见的杂交信号.
5试剂
5.1试剂组分
试剂组分和存放条件参见附录A.试验用水应符合GB/T6682的要求.
5.2引物
PCR反应使用的引物序列应符合表1的规定.
表1PCR反应使用的引物序列
扩增片段大小物种 目标基因 引物名称 序列 bp内参基因 18S rRNA Forward 5'-AGCCTGAGAAACGGCTACC-3 180基因 Reverse 5′'-biotin-TGCTGGCACCAGACTTGC-3′绪 cox1 Forward 5′-ACCGTAGGAATAGACGTG-3′ 154Reverse 5'-biotin-TGAAGCCCAGAGCTCATAG-3′黄牛 (or] Forward Reverse 5'TTACAACAATTATCAACATAA-3' 5′'-biotin-CCGGGTCGAAGAAGGTTGTA-3′ 174Forward 5'-GGCCTATACTATGGATCATATAC-3羊 cytb Reversc 5′-biotin-AATTGCTGAAAGGAGGTTGGT-3′ 159Forward 5′-CCACCTCACCTTCCTACAC-3′鸡 yb Reverse 5'-biotin-GAAATGGAATTTTGTCA-3′ 77
表1（续）
扩增片段大小物种 目标基因 引物名称 序列 bp免 cyr6 Forward 5′-GAAACTGGCTCCAACAAC-3 96Reverse 5'-biotin-AAGGAAACCTAGGGTGTCTTTG-3驴 cy Forward 5′'-GGAGCAACGGTCATTACAAA-3′ 134Reverse 5'-biotin-GGTAGAATAAAGTGGAAGGCAA-3智 cyrb Forward Reverse 5′-GTCATCTCAGCACTAGCAG3 107Forward 5'-biotin-TAGGGGTGAAAGGGGATTT-3' 5'-TTTGCCCACTGATTCCCCTT-3′Reverse 5'-biotin-CATGTTCACCCCTACGAATAT-3′ 93Forward 5'-ACATACGAAAAACACACC-3′R crh Reverse 5'-biotin-TCCTAGAAGGGACCCAA-3 107耗牛 D-loop Forward 5′-CTAACAACACACATCCCCAA-3′ 176Reverse 5′'-biotin-TTATGTACGATTAATAATT-3′ATPase 6 Forward 5′'-ACAGAAGGAAACCGAA-3 180Reverse 5'-biotin-TCCGATGATCACGTGGAGTCC-3
5.3阳性寡核苷酸单链DNA序列
阳性寡核苷酸单链DNA序列应与阳性对照核酸探针（PC）序列互补，5'编带生物素（biotin）标记，浓度为10μmol/L，用于膜芯片杂交过程质量控制.序列如下：
5'-biotin-CTGGTACTTTGGACACTCGTTCTTCTCGCACTGCTCATTATTGCTTCTGATCT-GGATGC-3'
5.4探针
膜芯片表面包被的目标基因探针序列应符合表2的规定.
表2目标基因探针序列
名称 序列18S rRNA 基因 5'-AminolinkerO6-AAGGAAGGCAGCAGGCGCGCAAAT-3猪 5′-AminolinkerC6-GAGCATACTTTACATCTGCCACAATAATCATIGCTATTCCC-3黄牛 5′-AminolinkerC6-AACCCCTCTATTCGTATGATCCG3′羊 5′-AminolinkerC6-TGGATCATATACCTTCCTAGAAACATG-3′兔 鸡 5'-AminolinkerC6-CCTAGGCATCTCATCCGACTC-3' 5′'-AminolinkerC6-ACAACCCCACAGGAATTCCTTCAAAC-3′5′'-AminolinkerC6-ATCGGTACTACGCTCGTCGAATGAATC-3′5′-AminolinkerC6-GGAATCCCATCTGATTCAGAC-3
