中华人民共和国国家标准
GB 5009.311-2026
食品安全国家标准
食品中白僵菌素和恩镰孢菌素的测定
中华人民共和国国家卫生健康委员会 国家市场监督管理总局 发布
食品安全国家标准
食品中白僵菌素和恩镰孢菌素的测定
1范围
本标准规定了食品中白福菌素（BEA）和恩肇孢菌素A（ENA）、恩镰孢菌素A（ENA）、恩镰孢菌素B（ENB)、恩孢菌素B（ENB）的液相色谱-质谱/质谱法.
本标准适用于谷物及其制品、培烤食品、特殊膳食用食品中BEA、ENA、ENA、ENB、ENB.的测定.
2原理
试样经酸性乙睛水溶液提取，固相萃取柱净化，液相色谱-质谱/质谱仪检测，外标法定量.
3试剂和材料
除非另有说明，本方法所用试剂均为分析纯，水为GB/T6682规定的一级水.
3.1试剂
3.1.1乙晴（CHCN）：色谱纯.3.1.2乙酸铵（CH COONH，）：色谱纯.3.1.3乙晴（CHCN).3.1.4乙酸（CHCOOH).
3.2试剂配制
3.2.1乙晴-水-乙酸溶液（84151）：量取150mL水、10mL乙酸加人到840mL乙中，混匀.3.2.25mmol/L乙酸铵溶液：称取0.39g乙酸铵，用水溶解并定容至1000mL.混匀.3.2.3乙晴-水溶液（4060）：量取40mL乙晴加人到60mL水中，混匀.
3.3标准品
3.3.1白僵菌素（C：HNOCAS号：26048-05-5）：浓度为100μg/mL的标准溶液，或纯度≥98%的标准品.3.3.2恩孢菌素A（CHNO，CAS号：2503-13-1）：浓度为100pg/mL的标准溶液，或纯度≥ 98%的标准品.3.3.3恩孢菌素A（C：HN O，CAS号：4530-21-6）：浓度为100μg/mL的标准溶液，或纯度≥98%的标准品.3.3.4恩镰孢菌素B（CHNO ，CAS号：917-13-5）：浓度为100μg/mL的标准溶液，或纯度≥98%3.3.5恩镰孢菌素B;（CHN O ，CAS号：19914-20-6）：浓度为100μg/mL的标准溶液，或纯度≥ 的标准品.
98%的标准品.
3.4标准溶液配制
3.4.1混合标准储备液（1.00μg/mL）:分别吸取 BEA ENA、ENA、EN B、EN B，标准品溶液（100μg/mL）各1.00mL于100mL容量瓶中，用乙晴稀释并定容至刻度，混匀.-18℃及以下温度条3.4.2混合标准使用液（100ng/mL）：吸取标准储备液10.0mL于100ml容量瓶中，用乙晴稀释并定 件密封避光保存，有效期2个月.容至刻度，混匀.一18℃及以下温度条件密封避光保存，有效期2个月.3.4.3标准系列工作液：分别吸取混合标准使用液和混合标准储备液适量，用乙晴配制成浓度分别为0.125ng/mL、0.500ng/mL、1.00 ng/mL5.00 ng/mL 40.0 ng/mL 的标准系列工作溶液.临用现配.
3.5材料
3.5.1玻璃纤维滤纸：孔径1.6pm，或相当者.3.5.2通用型固相萃取柱（200mg/6mL)：填料为脲基极性改性的N-乙烯基毗略烷酮-二乙基苯聚合3.5.3有机滤膜：孔径0.22cm. 物.或相当者.
4仪器和设备
4.2天平：感量为0.01g. 4.1液相色谱-质谱/质谱仅：配有电喷雾离子源.4.3匀浆机.4.4高速粉碎机.4.5组织接碎机.4.6涡旋振荡器：转速≥1000r/min 4.7涡旋混合器.4.8高速离心机；转速≥8000r/min.4.9固相萃取装置.4.10氮吹仪.
5分析步骤
5.1试样制备与保存
5.1.1试样制备
检测用的样品量应大于1kg：当样品量不足1kg时，至少取同一批次的3个包装，缩分后取不低于0.5kg.其中，固体样品用高速粉碎机粉碎，半固体样品用组织搞碎机捣碎，液体样品用匀浆机匀浆.注1：对于柔韧性样品/高黏度样品等特殊样品可以采取冷冻或加水匀浆（饺子皮样品：水一1：1或根据实际需要加 水制备使试样均匀）等措施进行制样.
注2：根据检验目的可按实际情况取样制备.
5.1.2试样保存
制备后混合均匀的试样均分至约100g的多个包装，储存于洁净的容器内，密封后根据样品性质置
于2℃~6℃或18℃及以下避光保存.
5.2试样提取
称取5g试样（精确至0.01g）于离心管中，加人20.0mL乙晴-乙酸水溶液，混匀，涡旋振荡30 min，8000r/min离心5min，取上清液备用.
注：柔韧性样品/高黏度样品等加水制备试样：称取试样10g（精确至0.01g）于高心管中，加人25.0ml.乙晴-乙酸水溶液.其他操作步骤同上.
5.3试样净化
吸取5.0mL上清液，用水稀释至15mL，混匀.若样品稀释液浑浊，则8000r/min离心5min.
将固相萃取柱连接至固相萃取装置，先后用5mL乙晴和5ml水活化平衡固相萃取柱，准确吸取部流出液，抽干小柱.准确加人2.0ml乙晴洗脱小柱，在30℃～40℃水浴下用氮气吹至近干.加人 1.0mL.乙晴涡旋混合器混匀30s溶解残留物，0.22μm滤膜过滤，收集滤液于进样瓶中，供测定.
注：柔韧性样品/高黏度样品等加水制备试样：吸取7.5ml.上清液用水稀释至20ml.-其他操作步骤同上.
5.4仪器参考条件
5.4.1色谱参考条件
a）色谱柱：C柱（柱长50mm，柱内径2.1mm，填料粒径1.7gm），或相当者：b）柱温：30C； c）进样量：3pL;d）流速：0.3mL/min；e）流动相：A相：5mmol/L乙酸铵溶液：B相：色谱纯乙睛；f）梯度洗脱程序参见表1.
表1梯度洗脱程序
时间 流动相A 流动相Bmin %0 0 45 551 0 45 556 0 0 1008 5 1009 5 45 5512.0 45 55
5.4.2质谱参考条件
a）离子化模式：电喷雾电离正离子模式：b）多反应监测（MRM），监测离子参数见表2；c）毛细管电压：1.0kV： d）离子导人接口温度：150℃；
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e）锥孔反吹气流量：150L/h；f) 脱溶剂气温度：450℃；g）脱溶剂气流量：1000L/h.
表2白僵菌素和恩镰孢菌素监测离子
化合物 母离子 m/x 子离子 m/x 徐孔电压 V 碰撞能量 eV244 2* 33 33BEA 801 8 262.2 33 33210.2 * 35 35EN A 699 8 228.2 35 30EN A: 685 8 210.2 * 35 30228.2 35 35EN B 657 7 196 2 * 35 30214.2 35 30‘ N3 671 7 196 2 * 210.2 32 32 30 30注：定量离子.
5.5标准曲线的制作
各目标化合物的浓度为横坐标，以各目标化合物峰面积的响应值为纵坐标，绘制标准曲线.标准溶液的液相色谱-质谱/质谱图参见附录A图A.1.
5.6定性判定
在相同测试条件下，试样溶液与标准溶液中各目标化合物的保留时间相比，相对偏差在土2.5%之内.定性离子均检出（S/N≥3），且定性离子和定量离子的相对离子丰度应当与浓度相近的标准工作液中的相对离子丰度一致，其相对离子丰度偏差应符合表3要求.
表3相对离子丰度的最大允许偏差
相对离子丰度/%最大允许编差/% 50 20≤<50 10≤<20 <10±20 ±25 ±30 ±50 5.7试样溶液的测定 将试样溶液注入液相色谱-质谱/质谱仪中，得到各目标化合物峰面积，根据标准曲线得到待测液中各目标化合物的浓度.待测样液中各目标化合物的响应值应在标准曲线线性范围内，超过线性范围则应适当稀释后重新测定.
