中华人民共和国国家标准
GB/T35520-2017
Chemicals-Embryotoxicity-Embryonic stem cell test
中国国家标准化管理委员会 中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局 发布
前言
本标准按照GB/T1.1一2009给出的规则起草.
本标准由全国危险化学品管理标准化技术委员会（SAC/TC251）提出并归口.
本标准起草单位：中国检验检疫科学研究院、中国化工经济技术发展中心、常州进出口工业及消费品安全检测中心、宁波出人境检验检疫局.
本标准主要起草人：李海山、陈会明、韩辉、崔媛、王晓兵、刘君峰、陈小青、程艳、艾文超、谢文平.
引言
小鼠胚胎干细胞（Embryonic stem cells，ES）在不同的培养条件下会分化为不同的胚胎组织.因此，一些研究小组使用小鼠ES细胞进行体外胚胎毒性试验.Laschinski等比较了ES细胞和小鼠纤维母细胞的细胞毒性，以评估致畸物的潜在胚胎毒性.Heuer等比较了ES细胞的细胞毒性和分化够被正确分类.这可能是由于在ES试验中选择2个终点不足以评估胚胎毒性.
为克服上述ES细胞试验的限制，Spielmann等确定了3个不同的试验终点（半数分化抑制浓度、D3细胞半数生长抑制浓度和3T3细胞半数生长抑制浓度）.根据这些终点可导出3个变量.所得的 3个变量作为受试物分为3个体内胚胎毒性等级的依据.这种方法有利于给出胚胎组织与成体组织之间对化合物细胞毒性损伤的敏感性差异.事实上，利用判别分析已将16种受试化学品正确归人已知的3种体内胚胎毒性等级.这是第一个不处死妊娠动物而获得体外培养所需胚胎组织的体外胚胎毒性测试.
向于自发分化. 在本标准中为验证研究制定的标准操作程序克服了实验室中ES状态维持的问题，ES细胞通常倾
此外，根据制定的性能标准，欧盟替代方法验证中心（European Centre for the Validation ofAlternativeMethods，ECVAM）验证研究表明体外数据和体内数据之间具有较好的相关性（准确性78%）.据报道，强胚胎毒性化学品的预测性（100%）极好、精确度（81%）良好.据报道，无胚胎毒性物质和胚胎 毒性弱的物质的预测性（分别为72%和70%）和无胚胎毒性物质的精确度（70%）较高（≥65%）.
然而，一个特例出现于强胚胎毒性化学品氯化甲基汞的错误分类，在8个试验中的4个试验里被预测为无胚胎毒性的化学品，而不是强胚胎毒性的化学品.这种误分类出现的原因可能是用于建立预测模型的训练集未包括具有类似细胞毒性模式的化学品.
化学品胚胎毒性胚胎干细胞试验
1范围
本标准规定了化学品胚胎毒性胚胎干细胞试验的术语和定义、试验原理、试验方法、质量控制和结果评价.
本标准适用于应用胚胎干细胞试验测试化学品的胚胎毒性.
2术语和定义
下列术语和定义适用于本文件.
2.1 半数分化抑制浓度median inhibition of differentiationID;化学品抑制50%ES细胞分化为心肌细胞的浓度.
2.2IC D3细胞半数生长抑制浓度median inhibition ofgrowthof D3化学品抑制50%ES细胞系D3生长和活性的浓度.
2.33T3细胞半数生长抑制浓度medianinhibitionofgrowthof3T3IC D化学品抑制50%3T3细胞生长和活性的浓度.
3试验原理
胚胎毒性测试或用妊娠动物进行体内试验，或用培养的胚胎以及取自妊娠动物的胚胎组织、细胞进行体外试验.不管体内还是体外测试，都得处死妊娠动物.利用胚胎干细胞体外培养无限增殖与分 化的潜能，提出了一种利用小鼠永生化细胞系的体外胚胎毒性测试，即胚胎干细胞试验.
本试验是基于胚胎毒性作用中最重要的指标，即受试物对胚胎组织和成体组织的毒性损伤存在敏感性差异，这种差异与胚胎分化抑制密切相关.使用两个永生化小鼠细胞系，ES细胞（D3）和纤维母细胞（3T3细胞）分别表示胚胎组织和成体组织.只有在添加小鼠白血病抑制因子（mLIF）的培养条件下，ES细胞保持在未分化阶段才可进行该试验.去除未分化状态，ES细胞会形成拟胚体（EB），并在适当 条件下分化为主要胚胎组织.
细胞毒性数据表明，ES细胞比成体细胞对毒性药剂更敏感.ES细胞分化抑制和ES细胞与3T3细胞生长抑制是EST中用于预测化学品潜在胚胎毒性的3个选用的终点.
4试验方法
4.1材料
4.1.1细胞系
BALB/c3T3细胞，细胞克隆A31号，建议使用德国，Eschewege，ICN-Flow（编号：03-465-83）或美国典型培养物保藏中心（ATCC：编号：CCL-163）.小鼠ES细胞D3，建议使用RolfKemler教授（德国源细胞，需验证其有效性. 弗莱堡马克斯普朗克研究所）或美国典型培养物保藏中心（ATCC：编号：CRL-1934），若使用其他来
4.1.2主要设备
细胞培养箱（37℃±1℃，5%±1%CO）、层流洁净工作台、水浴槽（37℃±1℃）、相差显微镜、酶标仪、细胞计数器等.
4.1.3化学品、培养基、血清
DMEM培养基、L-谷氨酰胺、胎牛血清（FCS）、胰蛋白酶/EDTA溶液、青霉素/链霉素、二甲亚矾（DMSO）、非必需氨基酸（NAA）、3-疏基乙醇（β-ME）、小鼠白血病抑制因子（mLIF）、噻唑蓝（MTT）、蓝、乙醇等. 异丙醇、十二烷基磺酸钠（SDS）、不含钙镁的磷酸盐缓冲液（PBS）、5-氟尿嘧啶（5-FU）、青霉素G、台盼
4.2试剂的准备
4.2.1小鼠白血病抑制因子
产品原液（mLIF）进行ES细胞常规传代时直接加入培养板或培养瓶.LIF溶液浓度为10U/mL，LIF，则在PBS（含1%BSA）或细胞培养基中制备1：10稀释液，并按照厂家说明书如上进行储存. 一20C下分装储存.解冻后，将分装LIF溶液储存在4C（1年稳定）.如果使用浓度为10”U/mL的
4.2.2胎牛血清
FCS解冻后在56C下30min热灭活.
4.2.3-硫基乙醇
在PBS中制备10mmol/Lβ-ME工作液，最长可使用1周（4C储存）.
4.2.4完全培养基
制备不含LIF的完全培养基.完全培养基最长使用1周（4C储存）. 完全培养基配方见表1.
表1完全培养基配方
用途 3T3 细胞 ES 细胞10% FCS 4 mmol/L L-谷 氨酰胺 50 U/mL 20%FCS 2 mmol/ILL谷氨酰胺 50U/mL.青霉常规培养 青霉索，50μg/mL链霉素 ME.1 000U/mlm LIF（直接加人培养板中） 素 50 pμg/mL 链霉素 1% NAA 0 1 mmol/L. β-
