中华人民共和国国家标准
GB/T37077-2018
Determination of cholesterol in eggs--Enzymatic method
中国国家标准化管理委员会 国家市场监督管理总局 发布
前言
本标准按照GB/T1.1-2009给出的规则起草.本标准由中华人民共和国农业农村部提出.本标准由全国畜牧业标准化技术委员会（SAC/TC274）归口.本标准主要起草人：高玉时、葛庆联、马丽娜、唐修君、陈大伟、刘茵茵、张静、张小燕、蒲俊华、 本标准起草单位：农业农村部家禽品质监督检验测试中心（扬州）、中国农业科学院家禽研究所唐梦君、樊艳风、顾荣.
禽蛋中胆固醇含量的测定酶法
1范围
本标准规定了酶法测定禽蛋中胆固醇含量的方法.本标准方法检出限为1mg/100g，定量限为3mg/100g. 本标准适用于鸡蛋、鸭蛋、鹅蛋、鸽蛋、鹤鹉蛋等鲜禽蛋.
2规范性引用文件
件.凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括的修改单）适用于本文件. 下列文件对于本文件的应用是必不可少的.凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文
GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法
3原理
胆固醇酯在胆固醇酯酶作用下水解为游离胆固醇和脂肪酸，胆固醇在胆固醇氧化酶作用下，生成△4-胆笛烯酮和HO，HO：在4-氨基安替比林及苯酚参与下，经过氧化物酶作用，生成红色醒亚胺.在波长505nm处测定样品吸光度，醋亚胺吸光度与样品中胆固醇含量成正比.根据其吸光度与标准曲线比较或由标准曲线回归方程计算样品中胆固醇含量.
4试剂或材料
除非另有说明，本标准所用试剂均为分析纯，水为GB/T6682规定的三级水.
4.2乙醚（CHO）. 4.1甲醇（CH;OH）.4.3无水乙醇（CHO）.4.4氢氧化钾（KOH）.4.5氯化钠（NaCl）.4.6胆固醇酯酶（EC3.1.1.13）：来源于微生物（如假单胞菌属、念珠菌属），葡萄糖氧化酶与尿酸酶含量 小于0.01%，不含过氧化氢酶，比活性约100kU/g酶蛋白（25℃，胆固醇油酸酯为底物）.4.7胆固醇氧化酶（EC1.1.1.6）：来源于微生物（如诺卡氏菌、球孢链霉菌）.葡萄糖氧化酶与尿酸酶含量小于0.01%，不含过氧化氢酶，比活性约45kU/g酶蛋白（37C，胆固醇为底物）.4.8过氧化物酶（EC1.11.1.9）：来源于辣根，纯度值（Reinheitszahl比值，Am/Asm）约为3.0，比活 性1000kU/g酵蛋白[25C，2，2'-连氮基-双-（3-乙基苯并二氢噻唑啉-6-磺酸）（ABTS）为底物].4.9胆固醇（CHO CAS号：57-88-5）：纯度≥99%.4.10氢氧化钾溶液（600g/L）：称取600g氢氧化钾，加水溶解并定容至1000mL，摇匀.4.11氯化钠溶液（50g/L）：称取50g氯化钠，加水溶解并定容至1000mL.摇匀.4.12磷酸氢二钠溶液（0.3mol/L）：称取107.4g磷酸氢二钠（NaHPO12HO），加水溶解并定容 至1000mL，摇匀.
GB/T 37077-2018
4.13磷酸二氢钠溶液（0.3mol/L）：称取46.8g磷酸二氢钠（NaHPO2HO)，加水溶解并定容至1 000mL 摇匀.4.14磷酸盐缓冲溶液（0.3mol/L）：量取89.6mL磷酸氢二钠溶液（4.12）和10.5mL磷酸二氢钠溶液（4.13），混匀，必要时用盐酸溶液或氨水溶液调节pH值至7.7土0.02.1 500 U/L的过氧化物酵、172.0mg胆酸钠（CH，NaO;）、10.2mg4-氨基安替比林（CHNO）、 4.15显色剂：取80U/L~100U/1的胆固醇酯酶、40U/L~60U/L的胆固醇氧化酶、1 000U/1~33.0mg苯酚（CH;OH）、300.0mg聚乙二醇辛基苯基醚（TritonX-100）置于100mL的容量瓶中，用0.3mol/L磷酸盐缓冲溶液（4.14）稀释至刻度.临用时配制.4.16胆固醇标准储备液（2.0mg/mL）：准确称取200.0mg胆固醇，加无水乙醇溶解并定容至100mL，摇匀.置于4℃冰箱中，有效期6个月. 4.17胆固醇标准系列工作液：分别吸取胆固醇标准储备液（4.16)0.0mL、2.0ml、4.0mL 6.0mL、8.0mL、10.0mL，用无水乙醇定容至10mL，该标准系列工作液的浓度分别为0.0mg/mL、0.4 mg/mL、0.8 mg/mL.1.2 mg/mL、1.6 mg/mL 2.0 mg/mL.. 现用现配.
5仪器设备
5.1天平：感量为0.1mg.5.2匀浆机.5.4涡旋混勾器. 5.3电热恒温水浴锅.5.5旋转蒸发仪.5.6分光光度计.
6样品
6.1全蛋样品
取2个～3个样品，鸽蛋等小蛋可适当增加样品数量，去壳，将全蛋于匀浆机充分混匀，储于清洁容器中，作为全蛋样品.
6.2蛋黄样品
取2个~3个样品，鸽蛋等小蛋可适当增加样品数量，去壳和蛋清，用滤纸吸干蛋黄表面的蛋清，将蛋黄于匀浆机充分混匀，储于清洁容器中，作为蛋黄样品.
7试验步骤
7.1胆固醇标准曲线的制作
应15min，取出冷却至室温.在波长505nm处，测定吸光度.以浓度为横坐标，吸光度为纵坐标制作 分别取60μL胆固醇标准系列工作液（4.17）和3.0mL显色剂（4.15），混匀后置于37℃水浴中反标准曲线.
7.2皂化
称取2.00g全蛋样品或1.00g蛋黄样品，精确到0.1mg，于50mL烧杯中，加人10mL氢氧化钾溶
液（4.10）和20mL甲醇，摇匀.65C水浴保温1h.每隔20min~30min振摇一次使皂化完全.
7.3提取
皂化完毕取出烧杯，冷却至室温，加水20mL，转移至125mL分液漏斗中，用乙醚萃取三次，每次15mL，振摇，静置分层后，收集三次乙醚萃取液于另一125mL分液漏斗中，加人3mL氯化钠溶液 (4.11)，水洗乙醚层至中性.
7.4浓缩
将水洗后的乙醚萃取液转移至100mL鸡心瓶中，50C水浴旋转蒸发浓缩至近干，用无水乙醇溶解并定容至10mL，作为待分析样液.
7.5样品测定
取60μL待分析样液和3.0mL显色剂，混匀后置于37C水浴中反应15min，取出冷却至室温.在波长505nm处，测定吸光度.
不同样品的前处理需要同时做空白试验.
8试验数据处理
样品中胆固醇含量以质量分数X计，数值以毫克每100克（mg/100g）表示，按式（1）计算：
式中：
p--由标准曲线查得或同归方程计算待分析样液中胆固醇浓度的准确数值，单位为毫克每毫升 (mg/mL);V待分析样液定容体积的数值（通常为10mL），单位为毫升（mL）；m一样品质量的数值，单位为克（g）.计算结果表示到小数点后一位.
9精密度
在重复性条件下获得的两次独立测定结果的绝对差值不得超过算术平均值的10%.
