中华人民共和国国家标准
GB/T 34776-2017
T4 DNA ligase-Detection methods of activity and impurities of enzyme
中国国家标准化管理委员会 中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局 发布
前言
本标准按照GB/T1.1-2009给出的规则起草.本标准由全国工具酶工作组（SAC/SWG11）归口本标准起草单位：中国测试技术研究院、深圳华因康基因科技有限公司、福建华灿制药有限公司. 本标准主要起草人：周李华、李怀平、盛司潼、孙登峰、谭辉彪、黄发灿、金虹、马丽侠、叶德萍、李花、王智、沈兴中谭和平.
T4DNA连接酶酶活及杂质检测方法
1范围
本标准规定了T4DNA连接酶的活力、杂质的检测方法.本标准适用于作为分子生物学研究用的T4DNA连接酶.
2规范性引用文件
下列文件对于本文件的应用是必不可少的.凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件.凡是不注日期的引用文件其最新版本（包括的修改单）适用于本文件.
GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法YY/T0087电泳装置YY/T0657医用离心机JG646移液器检定规程
3术语和定义
下列术语和定义适用于本文件.
3.1
DNA 连接酶DNA ligase
一种封闭DNA链上的缺口酶.借助ATP或NAD水解提供的能量催化相邻的核苷酸分子间3'-羟基和5'-磷酸基形成磷酸二酯键.
注：DNA连接酶催化底物可以是DNA或RNA，依据酶的类型不同，反应中产生高能中间产物的辅助因子可以是 ATP a NAD'
3.2
T4 DNA连接酶T4 DNA ligase
端和3-羟基末端形成磷酸二酯键.
注：带有 His-Tag分子质量约为70ku•来源于转化有T4 DNA 连接酶表达载体的 E Coi 菌标.主要作用是他化DNA末编之间的连接修复双链核酸中的单链切刻.
3.3
酶活力单位unit activity
在20L1×T4DNA连接酶反应缓冲液中，16C反应条件下，30min能使50%的经HindⅢ消化的aDNA片段[5端浓度为0.12pμmol/L（300μg/mL)]连接所需的酶量即为1活力单位.
4缩略语
下列缩略语适用于本文件.
GB/T 34776-2017
electrophresis)
Tris三（羟甲基）氨基甲烷（Tris（hydroxymethyl)metylaminomethane）.
5试剂与溶液
除非另有规定，本方法所用的试剂应为不含DNA和DNase 的分析纯试剂，试剂溶液宜大体积配制、小体积分装后经高压灭菌后使用，不宜高压灭菌的试剂应用0.22μm过滤器过滤除菌：酶缓冲液
应避免反复冻融：水为GB/T6682规定的一级水.5.1氯化钠（NaCI）.5.2琼脂粉（Agar）. 5.3氢氧化钠（Na(OH）.5.4乙二胺四乙酸二钠（NaEDTA，CH：NO;Na）.5.5TE缓冲液：10 mmol/L Tris-C1(pH 8.0)，1 mmol/L EDTA，使用 HCI或NaH调节pH.5.6酶贮存溶液：50 mmol/L KCl，10 mmol/L Tris-CI(pH 7.4），0.1 mmol/L EDTA，1 mmol/L5.7 10 × T4 DNA Ligase Buffer: 400 mmol/L Tris-C1 100 mmol/L MgCl 100 mmol/L DTT DTT 200 μg/mL BSA 和 50%的甘油.5 mmol/L ATP(pH 7.8) 5.850×TAE缓冲液：称取484 g Tris，量取114.2mL冰乙酸，200mL0.5mol/L EDTA（pH 8.0），溶于水中，定容至2L5.910×上样缓冲液：含0.25%澳酚蓝，0.25%二甲苯青FF，30%甘油水溶液.
6主要仪器和设备
6.1电泳系统：应符合YY/T0087的要求.6.2凝胶成像系统. 6.3加热制冷水浴/循环器：-20℃~100℃.6.4冷冻离心机：可以在4℃下进行离心，离心转速10000r/min以上，应符合YY/T0657的要求.6.5微量可调移液器：0.5μL~10pL，10pL~100μL，100μL~1 000μL，应符合 JJG646的要求.
7试验方法
7.1酶活力测定
7.1.1DNA-HindⅢ底物制备
入DNA-HindⅢ按照以下步骤进行制备：a）按表1配制酶切反应体系.加酶之前将反应混合物混匀（可以用移液枪上下吹打或轻弹管壁，切忌振荡混匀）：轻轻混匀，短暂离心.
表1酶切反应体系
试制名称 加样体积10×酶切缓冲液 40 pILx DNA(0.3 μg/μ1.1 60 pel.
表1（续）
试剂名称 加样体积Hind I (20 U/βL) 10 yLdd H (0 290 μI总体积 400 μL
b）37C反应4h.反应结束后向样品管中加入等体积的酚：氯仿：异戊醇（25：24：1），轻轻摇匀；12000r/min 离心8min.小心地将上清转移到新EP管中，不应吸到下面有机相里的液体，c）加人等体积的氯仿：异戌醇（24：1），轻轻摇匀：12000r/min离心8min.小心地将上清转移 到新EP管中.d）加人1/10体积的3mol/L醋酸钠颠倒混匀，再加2倍以上体积的无水乙醇，颠倒充分混匀后室温放置沉淀.e） 用适量75%~80%乙醇清洗白色沉淀2次. 放于超净台轻风将残余乙醇吹干，也可以室温蒸发.g）用适量的 TE缓冲液溶解DNA.h）紫外分光光度计和琼脂糖电泳检测DNA浓度和纯度（电泳检测结果条带清晰明亮，无杂带，范围分布在23130bp~125bp之间.紫外可见分光光度计测定产物的A/A在1.8~1.9 之间，A/A>2).
7.1.2T4DNA连接酶活力检测
按表2顺序配制20L连接反应体系，每个梯度设置3个平行.
表2酶活力测定反应体系
试制名称 加样体积10×T4DNA连接酶反应缓冲液 2 μL底物 DNA(-般用 XDNA-Hind I 片段) 1 pgddH;0 补齐至 20 pL参照酶’/待测酶 分别加人 0 0μL0 5 μL 1.5 p1 2 5 p1总体积 20 pL本标准暂采用NEBT4DNA酶为参照酶，待有市售T4DNA连接酶标准品时，可直接替换采用标准品作对照. 待测酶用贮存溶液稀释至1U/pl.酶不得含有杂质污染
构建连接酶的阳性对照组和无酶阴性对照组.
加酶之前将反应混合物混匀（可以用移液枪上下吹打或轻弹管壁，切忌振荡混匀）：轻轻混匀短暂快速离心，在最适温度下（一般为16C），反应30min，进行电泳（电泳条件参见附录A），观察连接情况：根据参照酶加人的最小体积乘以稀释倍数计算待测酶活力.具体计算方式可参见附录A.
7.2杂质检测
7.2.1核酸内切酶检测
按表3顺序配制连接反应体系.
