SN 中华人民共和国出入境检验检疫行业标准 SN/T4273—2015 国境口岸版纳病毒荧光PCR检测方法 Real time PCR detection methods of Banna virus at ports 2015-05-26发布 2016-01-01实施 中华人民共和国 发布 国家质量监督检验检疫总局 SN/T4273-2015 国境口岸版纳病毒荧光PCR检测方法 1范围 本标准规定了国境口岸版纳病毒的实时荧光RT-PCR检测方法，包括标本采集、处理，检验程序、 方法及结果判定. 本标准适用于国境口岸版纳病毒的实验室检测. 2缩略语 下列缩略语适用于本文件. 实时荧光RT-PCR:实时荧光反转录-聚合酶链反应 Ct值：每个反应管内的荧光信号达到设定的阈值时所经历的循环数 RNA:核糖核酸 FAM:FAM荧光染料，一种荧光报告基团 3术语和定义 下列术语和定义适用于本文件. 3.1 版纳病毒Banna virus 版纳病毒(Banna virus BAV)为12节段双链RNA病毒，是一种虫媒病毒，主要经蚊虫传播，可引 起人类发热和病毒性脑炎，目前该病毒主要分布在我国和印度尼西亚等地区.版纳病毒电镜下观察为 二十面体球形颗粒，表面有纤突，直径在60nm~70nm之间.病毒的基因组由12个节段的双链(dsR- NA)组成，全长约为21000bp. 3.2 实时荧光PCR real-time fluorescence PCR 实时荧光PCR方法是在常规PCR的基础上，加人一套可反映PCR扩增过程的荧光报告系统，通 过监测系统接收到荧光信号，实时判断每个反应管内目的基因的模板扩增情况. 4主要仪器设备 本方法使用的主要仪器包括荧光定量PCR仪、超净工作台、Ⅱ级生物安全柜、高压灭菌锅、低温高 速离心机（最大离心力20000×g)、玻璃研磨器、漩涡振荡器、冰箱(4℃、一20℃、一70℃或液氮罐）、移 液器等. 1 SN/T4273-2015 5主要试剂 本方法使用的主要试剂包括核酸提取试剂如Qiagen公司的QIAamp Viral RNA Kit'、实时荧光 RT-PCR通用试剂如Ambion公司的Ag-Path-IDTM One step RT-PCR Kit、PBS溶液(pH7.O)、无 RNA酶的DEPC水、引物和探针（针对版纳病毒V2基因片段编码区核苷酸高度保守区进行设计，引 物和探针序列见表1等. 表1版纳病毒实时荧光RT-PCR检测的引物和探针 引物/探针名称 序列(5'-3) 扩增片段大小 Banna-FP CGTAATTTTATGGACCACCTGGA Banna-RP CATAAGAAGCATGGCGACCTAG 82 bp Banna-probe FAM-CTACTGGTCCTGTGCCGTTAGGTCCC-BHQ1 6标本的采集与处理 6.1人体标本 无菌采集发热期可疑病人的静脉血或脑脊液等标本3mL5mL 血标本于室温静置30min使其 凝固，500×g离心10min 收集血清于2mL无菌螺口塑料管中，脑脊液则直接装入2mL无菌螺口塑 料管，用耐低温油性记号笔记上编号，低温送到实验室检测.如24五内不能送到实验室，将血清或脑脊 液置于一70℃保存. 6.2蚊标本 将采集的蚊子直接放入一20℃冰箱30min以上冻死后，取出，分类编号，一般按30~50只一份， 不足30只的可按采样点或分类归为一份，装人2mL.螺口塑料血清管内，旋紧管盖，做好编号.于 一70℃以下运输或保存.蚊标本处理时应在冰上操作.从一70℃容器中取出蚊...
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