中华人民共和国出入境检验检疫行业标准
SN/T 3731.4-2017代替SN/T3731.42013
食品及饲料中常见禽类品种的鉴定方法 第4部分：火鸡成分检测 实时荧光PCR法
Identification of poultry ingredient in food andfeedPart 4:Detection of turkey ingredient-Real-time PCRmethod
中华人民共和国 国家质量监督检验检疫总局 发布
前言
SN/T3731《食品及饲料中常见禽类品种的鉴定方法）共分为以下6个部分：
第1部分：转成分检测PCR法；第3部分：鸽子成分检测实时荧光PCR法； 第2部分：鹅成分检测PCR法；一第4部分：火鸡成分检测实时荧光PCR法：第5部分：鸭成分检测PCR法：第6部分：鹏成分检测实时荧光PCR法.本部分按照GB/T1.1-2009给出的规则起草. 本部分为SN/T3731的第4部分.本部分与SN/T3731.4-2013相比，主要技术变化如下：一检测用引物和探针序列.本部分由国家认证认可监督管理委员会提出并归口.本部分起草单位：中国检验检疫科学研究院、中华人民共和国上海出人境检验检疫局. 本部分主要起草人：张舒亚、吕蓉、谌鸿超、韩建助、刘月明、褚庆华、陈颖、吴亚君.本部分所代替标准的历次版本发布情况为：SN/T3731.4-2013.
食品及饲料中常见禽类品种的鉴定方法 第4部分：火鸡成分检测 实时荧光PCR法
1范围
SN/T3731的本部分规定了食品和饲料中火鸡成分的实时荧光PCR检测方法.本部分适用于食品和饲料中火鸡成分的定性检测，
2规范性引用文件
下列文件对于本文件的应用是必不可少的.凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件.凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括的修改单）适用于本文件.
GB6682分析实验室用水规格和试验方法GB/T27403实验室质量控制规范食品分子生物学检测
3术语和定义
下列术语和定义适用于本文件.
3.1 火鸡turkey属雄科（Phasianidae）火鸡属（Meleagris），学名Meleagris gallopavo.
3.2实时荧光PCRreal timePCR
在PCR反应体系中加人荧光基团，利用荧光信号的积累实时监控整个PCR扩增过程.
3.3Ct值cycle threshold每个反应管内的荧光信号达到设定的域值时所经历的循环数.
4缩略语
下列缩略语适用于本文件.PCR：聚合酶链式反应（Polymerase ChainReaction）DNA：脱氧核糖核酸（DeoxyribonuleicAcid）dNTP：脱氧核苷酸三磷酸（DeoxyribonucleosideTriphosphate） CTAB：十六烷基三甲基澳化铵（CetyltrithylammoniumBromide）Tris：三（羟甲基）氨基甲烷[Tris（Hydroxymethyl）Aminomethane]EDTA：乙二胺四乙酸（Ethylene DiaminetetraaceticAcid）Taq：水生栖热菌（Thermus αquaticus）
SN/T 3731.4-2017
OD：光密度值（OpticalDensity）
5方法提要
行实时荧光PCR扩增，观察实时荧光PCR的增幅现象，判断样品中是否存在火鸡成分. 样品经研磨后，提取DNA，以DNA为模板，采用火鸡的12SrRNA基因特异性检测引物和探针进
6试剂和材料
6.1检测用引物和探针
检测用引物和探针见表1.
名称 序列（5'-3） 目的基因大鸡成分5'端引物 GCCCTAAC CCUCTTAAGAAAAGAAT火鸡成分探针 火鸡成分3端引物 AGT AM-CTTGCTTGAGCCACACC-MGB GCTATGGCTAAGTCAAGTTTACAC 火鸡12SrRNA基因
6.2试剂
除另有规定外，试剂均为分析纯或生化试剂.实验用水符合GB/T6682的要求.试剂均用无DNA酶污染的容器分装.
6.2.8TE缓冲液（Tris-CI、EDTA缓冲波）：10 mmol/ITris-HCl（pH 8.0) 1 mmol/L EDTA(pH 8.0).
6.2.9实时荧光PCR反应混合液：12.5pL反应体系包括：1U~2U的Taq酶、1×PCR缓冲液、 2.5mmol/L~4.0mmol/L 的Mg²、0.2U~1U的UNG酶、0.2mmol/L的d（A，C G)TPs、0.2mmol/L~0.4mmol/LdUTP、400nmol/LROX染料（某些荧光PCR仪不需要ROX校正）.如果具有等效的商品化试剂盒，则可使用这些等效产品.
7仪器设备
7.4离心机：最大离心力要超过12000g.
7.1实时荧光PCR仪.
7.2核酸蛋白分析仪或紫外分光光度计.
7.3恒温水浴锅.
7.5微量移液器（2.5μL.20pL 200μL，1000μL），7.6研体及粉碎装置.7.7涡旅振荡器.7.9天平：感量0.01g. 7.8pH计.
8检验步骤
8.1DNA提取
将样品研磨后，称取200mg左右因体样品或200pl液体样品于2mL离心管中，加人1.5mlCTAB提取缓冲液和10pL蛋白酶K溶液.60C振荡过夜后13000g离心10min，转移上清液到新 的离心管中.加人750pL氯仿店用力振荡，13000g离心5min，将上请液转移到新的离心管中.加人2倍体积的CTAB沉淀溶液，室温静置60min-13000g离心15min，弃去上清液.加人350μLNaCI溶液将沉淀进行悬浮，再加人350μL氯，涡旋振荡进行混匀，13000g离心10min，转移上清液后加人0.6倍体积的异丙醇用来沉淀核酸，室温放置20min，13000g离心10min，弃去上清液.加人500pL70%乙醇溶液洗涤沉淀，溶解于200pLTE溶液中.立即使用或一20C保存备用.也可用 等效的DNA提取方法提取模板DNA.
8.2DNA浓度和纯度的测定
使用核酸蛋白分析仅或紫外分光光度计分别检测260nm和280nm处的吸光值A和Am.DNA的浓度按照式（1）计算，当Ax/A比值在17~1.9之间时，适宜于PCR扩增：
式中：
c--DNA浓度，单位为微克每微升（gpL.）：
A--260nm处的吸光值；
N-核酸稀释倍数.
8.3实时荧光PCR扩增
8.3.1反应体系的体积为25pL：实时荧光PCR湿合液12.5L.、正反向引物（10μmol/L）各1μL、探针（10μmol/L）1pL、模板DNA5μL，水补足至25μL，
8.3.2实时荧光PCR反应条件随仪器不同略有改变，一般为：50℃2min;95℃10min；95℃15s，60℃1min，40个循环.
8.3.3每个样品设置两个平行的反应体系，检测过程中应分别设立阳性对照、阴性对照和空白对照.用已知含火鸡成分的样品作阳性对照，用已知不含火鸡成分的样品作阴性对照，用等体积的双蒸水代替模板DNA作空白对照，
9质量控制
以下条件有一条不满足时，实验视为无效：
a）空白对照：无荧光对数增长，相应的Ct值一40.0；b）阴性对照：无荧光对数增长，相应的Ct值=40.0； c）阳性对照：有荧光对数增长，且荧光通道出现典型的扩增曲线，相应的Ct值<30.0.
