B 41 ICS 11.220
NY
中华人民共和国农业行业标准 NY/T 2960-2016
兔病毒性出血病病毒RT-PCR检测方法 DetectingmethodforrabbithaemorrhagicdiseasevirusbyRT-PCR
2016-10-26发布2017-04-01实施
中华人民共和国农业部发布
NY/T2960-2016
前言
本标准按照GB/T1.1一2009给出的规则起草。
本标准由全国动物卫生标准化技术委员会(SAC/TC181)归口。
本标准起草单位：中国动物卫生与流行病学中心、江苏省农业科学院兽医研究所、河南牧业经济 学院。
本标准主要起草人：邵卫星、王芳、魏荣、胡波、徐耀辉、魏后军、孙映雪、李卫华。
NY/T 2960-2016
兔病毒性出血病病毒RT-PCR检测方法
1范围 本标准规定了检测兔病毒性出血病病毒RT-PCR检测方法的技术要求。
本标准适用于检测疑似免病毒性出血病肝脏、脾脏、肺脏等脏器及鼻腔分泌物的兔病毒性出血病病 毒核酸。
2缩略语PUE 下列缩略语适用于本文件 EB：溴化乙锭（ethidium NDARD Oligo d(T)18 Prime RNA:核糖核酸(ribomucl eic acid) RT-PCR反转录聚合酶链式反应everse tra nscrip lymerase ction)。
Taq酶：TaqDNA聚合酶（taqDNAymera: TBE:Tris-硼酸电冰缓冲液。
bp:碱基对（basPi dNTPs：脱氧核糖核鲜酸（deoxyribonucleosidetriphosphates） 3仪器设备 3.1高速冷冻离心机：要求最大离心力 3.21PCR扩增仪 c 3.3核酸电泳仪和 3.4恒温水浴锅。
3.52°℃~8°℃冰箱AGI 3.6微量移液器（0.5uL10pL 3.7凝胶成像系统（或紫外透射仪） 3.8生物安全柜。
4试剂 4.1AMV反转录酶或其他反转录酶。
4.2RNA酶抑制剂。
4.3TaqDNA聚合酶。
4.4 dNTPs。
4.5TRIZOLRNA提取试剂。
4.61.0%琼脂糖凝胶，见A.1。
4.75XTBE缓冲液，见A.2。
4.8DNA染料：溴化乙锭（EB）。
NY/T2960-2016 警告：电泳中用到的EB可诱发基因突变，在操作中应戴手套和口罩。
试验中被EB污染的物品要 有专用收集处，并进行无害化处理。
4.9焦碳酸二乙酯(DEPC)水，见A.3。
警告：DEPC对眼睛和呼吸道黏膜有强刺激，在操作中应在通风条件下进行。
使用时戴手套和口 罩，不小心沾到皮肤应立即冲洗。
4.10异丙醇：一18℃以下预冷。
4.1175%乙醇：一18℃以下预冷。
4.12氯仿。
警告：氯仿毒性属中等毒性，吸入或经皮肤吸收会引起人体不适及皮肤黏膜刺激症状，在操作中应 在通风条件下进行。
使用时戴手套和口罩，不小心沾到皮肤应立即冲洗。
4.13DNA分子量标准(DL2000DNAMarker)。
4.146×电泳上样缓冲液。
5引物 5.1反转录引物见B.1。
5.2PCR引物见B.2。
6操作程序 6.1样品的采集及处理过程的注意事项 采样过程中样本不得交叉污染，采样、样品处理及RNA提取过程中应戴一次性手套和口罩。
6.2样品的采集及处理 6.2.1肝脏等脏器的采集和处理 无菌取疑似RHD死亡兔肝脏等脏器5g，分别剪碎作为检测样品。
同时，以RHD死亡兔和正常兔 肝脏等脏器分别作为阳性和阴性对照样品，同样处理。
一18℃以下冰箱可保存1个月。
运输过程中需 加冰袋保存。
6.2.2鼻腔分泌物的采集和处理 用DEPC水润湿棉签拭子，深人兔鼻腔内部涂抹数次，然后放到含0.2mLDEPC水的EP管中。
一18℃以下冰箱可保存1个月。
运输过程中需加冰袋保存。
6.3RNA的提取 6.3.1TRIZOL法 实验室没有商品化RNA提取试剂盒采用此方法。
将5倍样品量的DEPC水加入脏器组织中，研磨成悬液，装入DEPC处理过的EP管中，一18C以 下反复冻融3次，5000g离心5min，取200μL上清液作为待提取样品（浸泡于EP管中的棉签拭子，经 反复挤压5次后，5000g离心5min，取200pL上清液作为待提取样品）。
然后，加人700μLTRIZOL， 振荡混匀后，室温放置10min，加入氯仿300uL。
振荡混匀后，室温放置30min，4℃C10000g离心15 min。
取上层水相600μL,加入等体积的异丙醇，混匀，一18℃以下放置2h以上或过夜，4C10000g离 心15min...
