中华人民共和国国家标准
GB/T35806-2018
动物流感检测 H7N9亚型流感病毒 双重荧光RT-PCR检测方法
Animal influenza detection-Protocol of duplex real-time RT-PCRfor influenza virus subtypes H7 and N9
中国国家标准化管理委员会 中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局 发布
前言
本标准按照GB/T1.1-2009给出的规则起草.
本标准由农业部提出.
本标准由全国动物卫生标准化技术委员会（SAC/TC181）归口.
本标准起草单位：北京出入境检验检疫局检验检疫技术中心、中国出入境检验检疫协会、中国农业科学院哈尔滨兽医研究所、中国检验检疫科学研究院，
本标准主要起草人：蒲静、高志强、汪琳、乔彩霞、张锡全、周琦、张鹤晓、张伟、尹羿、柏亚铎、刘艳华、刘环、王秀荣、包红梅、韩雪清、王慧煜.
动物流感检测H7N9亚型流感病毒 双重荧光RT-PCR检测方法
1范围
本标准规定了同时检测H7和N9亚型动物流感病毒核酸的TagMan双重荧光RT-PCR操作方法.
本标准适用于H7和N9亚型动物流感病毒核酸的快速检测和筛查.
2规范性引用文件
下列文件对于本文件的应用是必不可少的.凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件.凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括的修改单）适用于本文件.
GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法GB/T19438.1-2004禽流感病毒通用荧光RT-PCR检测方法GB19489实验室生物安全通用要求
3缩略语
下列缩略语适用于本文件.
Ct（或Cp）值：每个反应管内的荧光信号量达到设定的网值所经历的循环数（ThresholdCycle，orCrossing Point)DEPC：焦碳酸二乙酯（Diethypyrocarbonate) FAM：骏基荧光素（Carboxyfluorescein）HA：血薇素（Hemagglutinin)HEX：六氯-6-甲基荧光素（Hexachloro fluorescein）MGB：小沟结合物（Minor GrooveBinder）NA :神经氨酸酶(Neuraminidase) TAMRA：基四甲基罗丹明（Carboxytetramethylrhodamine)荧光RT-PCR：实时荧光反转录聚合酶链反应（Real-timeRT-PCR）
4试剂和材料
4.1试剂
4.1.1总则：除另有说明，所用试剂均为分析纯，所用液体试剂均需使用无RNA酶的容器进行分装.4.1.2TRIzol:2C~25C保存.4.1.3氯仿：2℃~8C预冷.4.1.4异丙醇：-20C预冷. 4.1.5DEPC水：配方见A.1.
GB/T 35806-2018
4.1.675%乙醇：用新开启的无水乙醇和DEPC水配制，一20C预冷.4.1.7PBS（含青霉素和链霉素）：配方见A.2.4.1.8H7和N9亚型流感病毒双重荧光RT-PCR检测引物、探针序列，反应液配方见附录B.4.1.9阳性、阴性对照阴性对照：为已知流感病毒阴性的动物组织悬液. 阳性对照：为灭活的H7N9亚型流感病毒液或体外转录的H7和N9cRNA.
4.2仪器设备
4.2.1荧光PCR检测仪及配套反应管（板）.4.2.2高速台式冷冻离心机（离心速度不低于12000r/min）. 4.2.3台式离心机，4.2.4振荡器.4.2.5组织匀浆器.4.2.6冰箱（2℃C~8℃和-20C两种）.4.2.7微量移液器（5μL、10μL、100pl、1000pL）及配套吸头， 4.2.81.5mL离心管（无核酸酶）和5mL采样管.
5实验室的标准化设置与生物安全管理
GB 19489. 本方法的实验室设置与管理见GB/T19438.1一2004中的附录C：实验室生物安全管理见
6样品的采集与前处理
6.1总则
采样过程中样本不得交叉污染，采样及样品前处理过程中应戴一次性手套，注意无菌操作.
6.2采样工具
6.2.1采样专用商品化棉拭子、剪刀、镊子、研钵、5mL采样管、商品化一次性采样袋.6.2.2除商品化棉拭子、采样袋外，上述采样工具应经121℃土2C，15min高压灭菌并烘干或经 160℃干烤2h.
6.3样品采集
6.3.1拭子样品
根据动物种类，可采集咽联拭子、泄殖腔拭子（禽）或鼻拭子（猪等其他动物）.采集方法如下：取咽喉拭子时将拭子深入联头及上额裂来回刮2次～3次并旋转，取分泌液：取泄殖腔拭子时将拭子深人泄殖腔旋转一周并沾取少量粪便； -一取鼻拭子时将拭子深人鼻腔来回刮2次～3次并旋转，取分泌物.将采样后的拭子放入盛有2.0mLPBS（含青霉素和链霉素）的采样管中，编号.
6.3.2组织样品
病死禽采集肺脏或气管分泌物等组织；其他动物用无菌剪、摄采集肺脏等组织脏器，装人无菌采样
袋或其他灭菌容器，编号.
6.4样品购运
样品采集后置保温箱中，加人预冷的冰袋，密封，24h内送实验室.
6.5样品处理
6.5.1拭子样品
样品在振荡器上充分混合后，将拭子中的液体挤出，3000r/min离心5min，吸取上清液转入无菌的1.5mL离心管中，编号备用.
6.5.2组织样品
素）混匀，3000r/min离心5min后，取1.0mL上清液转入无菌1.5mL灭菌离心管中，编号备用. 用无菌的剪刀和镊子剪取待检样品2.0g于研中充分研磨再加10.0mLPBS（含青霉素和链霉
6.6样品存放
采集或处理好的样品在2C~8℃条件下保存应不超过24h：若需长期保存，应放置一70C冰箱中，但应避免反复冻融（冻融不超过3次）.
6.7其他样品说明
急性感染且出现病毒血症的动物也可采集全血分离血清或血浆进行检测.
H7N9流感病毒疫情监测需要采集环境样品，应根据具体环境情况采集可能含有流感病毒的样品，如笼具表面、禽乌粪便、产品加工砧板或用具表面等环境样品.
7双重荧光RT-PCR检测操作方法
7.1样本核酸的提取
7.1.1在样本制备区进行，采取TRIzol裂解法提取.也可采取其他等效的RNA提取方法. 7.1.2待检样品、阳性对照和阴性对照的份数总和用表示，取n个灭菌1.5mL离心管，逐管编号.7.1.3每管加入600μL TRIzol.7.1.4每管对应编号分别加人200pL待检样品、阳性对照或阴性对照，混匀.7.1.5每管加入200pL氯仿，充分颠混匀，于4℃、12000r/min离心15min.7.1.6新取a个灭菌的1.5mL离心管，逐管编号，每管加人500μL异丙醇（-20C预冷）. 7.1.7吸取7.1.5各管中的上清液500gL，转移至7.1.6相应的管中，避免吸出中间层，颠倒混匀.7.1.8于4℃、12000r/min离心15min，轻轻倒去上清，倒置于吸水纸上，沥干液体，不同样品应在吸水纸不同地方沥干.7.1.10于4℃、12000r/min离心10min，轻轻倒去上清，倒置于吸水纸上，沥干液体，不同样品应在 7.1.9每管加人600pL75%乙醇（-20C预冷），颠倒洗涤.吸水纸不同地方沥干.7.1.114000r/min离心10s将管壁上的残余液体甩到管底部用微量移液器尽量将其吸干.注意一份样本换用一个吸头，吸头不要碰到有沉淀一面.7.1.12室温干燥3min.不宜过于干燥，以免RNA不溶.7.1.13每管加人11pLDEPC水，轻轻混匀，溶解管壁上的RNA，2000r/min离心5s，获得RNA溶
