中华人民共和国国家标准
GB4789.42-2025
食品安全国家标准
中华人民共和国国家卫生健康委员会 国家市场监督管理总局 发布
前言
本标准代替GB4789.42-2016（食品安全国家标准食品微生物学检验诺如病毒检验》.本标准与GB4789.42-2016相比，主要变化如下：
食品安全国家标准
食品微生物学检验诺如病毒检验
1范围
本标准规定了食品中诺如病毒（Norovirus）的实时荧光RT-PCR检验方法.本标准适用于贝类、生食蔬菜、硬质表面食品、软质水果和包装饮用水中诺如病毒的检测.
2设备和材料
除微生物实验室常规灭菌及培养设备外，其他设备和材料如下.2.1实时荧光PCR仪.2.2低温离心机：离心力>12000×g温度≤4℃，套管容积适合1.5mL/50mL离心管.2.3无菌刀片或等效均质器. 2.4涡旋混匀仪.2.5电子天平：感量为 0.1g和0.1 mg.2.6全温振荡器或等效装置：温度范围2℃~60℃.2.7恒温水浴锅或恒温金属浴：温度范围为室温~100℃.2.8离心机：离心力>5000×g，套管容积适合50mL/15mL离心管. 2.9低温冰箱：-80℃2.10微量移液器.2.11pH计或精密pH试纸.2.12无菌均质袋：带滤网，容积400mL.2.14无菌贝类剥刀. 2.13无菌棉拭子.2.15橡胶垫.2.16无菌剪刀.2.17无菌镊子.2.18无菌培养Ⅲ. 2.19无RNase 玻璃容器、无RNase 离心管、无RNase移液器吸头、无RNase 药匙、无RNase PCR薄壁管：见附录E中E1.2.20超滤浓缩离心管（截留蛋白分子量50kD或100kD）.2.21无菌混合纤维素膜（孔径0.45pm，直径47mm）.
3培养基和试剂
除有特殊说明外，实验用试剂均为分析纯；实验用水均为无RNase超纯水（见E.2.1).3.1GI和GⅡI基因组诺如病毒引物和探针：见附录A.
3.2过程控制病毒引物和探针：见附录C.
3.3过程控制病毒：门哥病毒或大肠埃希氏菌噬菌体MS2，见附录C.3.5Tris/甘氨酸/牛肉膏（TGBE）缓冲液：见E.2.2.3.65XPEG/NaCI溶液：见E.2.3.3.8三氯甲烷/正丁醇混合液：见E.2.5. 3.7磷酸盐缓冲液（PBS）：见E.2.4.3.9蛋白酶K溶液：见E.2.6.3.1075%乙醇：见E.2.7.3.11Trizol 试剂：见E.2.8. 3.12盐酸（HC1）溶液（6mol/L)：见E.2.9.3.13氢氧化钠（NaOH）溶液（1mol/L)：见E.2.103.14果胶酶：Aspergillus niger 果胶酶，活性≥5U/mg：或Aspergillus aculeatus 果胶酶，活性≥3 800 U/mL 3.15氯化镁.
3.4外加扩增控制RNA：见附录D.
4检验程序
诺如病毒检验程序见图1.
图1诺如病毒检验程序
5操作步骤
5.1样品处理
待检样品一般应在4C以下的环境中进行运输.实验室接到样品后应尽快进行检测，如果在24h内不能检测，应将样品保存在一80C冰箱中，实验前取出，放置室温，至样品完全解冻.样品处理和PCR检测应防止交叉污染.每个样品可设置2个～3个平行处理.样品处理过程中，要注意更换剪刀、 镊子、移液器吸头等实验耗材，防止样品间的交叉污染.
5.2病毒提取
5.2.1软质水果和生食蔬菜
5.2.1.1将25g软质水果（由子房发育成的柔软多汁的肉质水果的统称，如草莓、葡萄）或生食蔬菜（如生菜）在无菌条件下切成约2.5cm×2.5cm×2.5cm的小块（如水果或蔬菜小于该体积，可不切）.
5.2.1.2将样品小块移至无菌均质袋（带滤网，容积400mL）中，加人10pL过程控制病毒，再加人40mL胶酶）. TGBE缓冲液（软质水果样品，需加人30U Aspergilus miger果胶酶，或1 140 U Aspergillus aculeatus果
5.2.1.3使用全温振荡器，在室温条件下，60次/min，振荡20min.酸性软质水果（软果经焚烧后的灰分溶解在水中后pH小于7.0的软质水果，例如草莓、杨梅、覆盆子）需在振荡过程中，每隔10min测定pH，当pH低于9.0时，使用1mol/1 NaOH调pH至9.5.每调整1次pH，延长振荡时间10min.
5.2.1.4将提取液转移至50mL离心管，如体积较大，使用2支离心管.10000×g，4℃，离心30min.取上清至无菌试管或三角瓶，用6mol/LHCl调pH至7.0.
5.2.1.5向提取液中加人0.25倍提取液体积的5XPEG/NaCI溶液，使PEG/NaCI在提取液中的终含量为100g/LPEG，0.3mol/LNaC1.室温，摇匀1min，然后，4C，60次/min.振荡60min或4C静置过夜.10000×g，4℃，离心30min，弃上清.10000×g，4℃，离心5min紧实沉淀，弃上清.
5.2.1.6加人500μLPBS重悬沉淀，如样品为生食蔬菜，直接将重悬液转移至无RNase离心管中，测 定并记录重悬液体积，用于后续RNA提取.如样品为软质水果，将重悬液转移至耐三氯甲烷的无菌离心管中，加人500pL三氯甲烷/正丁醇混合液，涡旋混匀，室温静置5min，10000×g，4℃C，离心15min，将上清液转移至无RNase离心管中，测定并记录上清液体积，用于后续RNA提取.
5.2.2硬质表面食品
5.2.2.1将无菌棉拭子使用PBS湿润后，用力擦拭食品表面（如胡萝下、瓜、坚果，50cm≤擦拭面积≤100cm²），记录擦拭面积.将10pL过程控制病毒添加至该棉拭子.如果食品表面过于租糙，可能会损坏棉拭子，可使用多个棉拭子，但只需在其中一个棉拭子上添加过程控制病毒.
5.2.2.2将棉拭子浸人含490gLPBS试管中，紧贴试管一侧挤压出液体.如此重复浸人和挤压3次～4次，确保挤压出最大量的病毒，测定并记录液体体积，用于后续RNA提取.
5.2.3贝类
5.2.3.1戴上防护手套，使用无菌贝类剥刀打开至少10个贝类样本.5.2.3.2使用无菌剪刀、无菌镊子或其他等效器具在橡胶垫上解剖贝类样本，取出贝类消化腺，置于无菌培养Ⅲ中.收集2g贝类消化腺. 5.2.3.3使用研钵或等效均质器将贝类消化腺匀浆后，转移至离心管.加人10gL过程控制病毒.加人2.0mL蛋白酶K溶液，混匀.5.2.3.4使用全温振荡器或等效装置，37C.320次/min，振荡60min.5.2.3.5将离心管放人水浴或等效装置，60℃，15min，随后，3000×g，室温，离心5min，将上清液转移至无RNase离心管中，测定并记录上清液体积，用于后续RNA提取.
5.2.4包装饮用水
5.2.4.1取包装饮用水样品（≤1000mL），加人10pL过程控制病毒，振荡混匀.5.2.4.2向样品中加人一定质量的氯化镁（例如每升包装饮用水中加人4.76g氯化镁），充分溶解并混匀，使Mg终浓度为0.05mol/L.
