T/SHAAV 标 准
T/SHAAV028-2025
副猪格拉瑟菌MALDI-TOFMS快速鉴定方 法
MALDI-TOF-MS Rapid Identification Method of Glaesserella parasuis
上海市畜牧兽医学会 发布
目 次
前1范围2规范性引用文件.3术语和定义4缩略语.5原理6试剂和材料.7仪器与设备. 78操作步骤.9结果报告.10生物安全及防污染措施附录A（规范性）质谱仪的校准附录B（资料性）副猪格拉瑟菌质谱数据库的建立.
前言
起草.
请注意本文件的某些内容可能涉及专利.本文件的发布机构不承担识别专利的责任.
本文件由上海市畜牧兽医学会提出并归口.
图生物工程股份有限公司、中元汇吉生物技术股份有限公司. 本文件起草单位：上海市动物疫病预防控制中心、上海市松江区农产品质量安全检测中心、郑州安
本文件主要起草人：沈莉萍、徐锋、王晓旭、张玉杰、齐新永、王建、赵洪进、金一春、徐平、唐聪圣.
河北省动物疫病预防控制中心、梅里埃诊断产品（上海）有限公司、郑州安图生物工程股份有限公司、 本文件首批承诺执行单位名单：中国农业科学院上海兽医研究所、上海市动物疫病预防控制中心、中元汇吉生物技术股份有限公司、上海中江举帆科技有限公司.
副猪格拉瑟菌MALDI-TOFMS快速鉴定方法
1范围
本文件适用于副猪格拉瑟菌病的病原学检测与鉴定. 本文件规定了副猪格拉瑟菌的MALDI-TOFMS鉴定方法.
2规范性引用文件
下列文件中的内容通过文中的规范性引用面构成本文件必不可少的条款.其中，标注日期的引用文件，仅该日期对应的版本适用于本文件：不注日期的引用文件，其最新版本（包括的修改单）适用 于本文件.
GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法GB/T33682基质辅助激光解析电离飞行时间质谱鉴别微生物方法通则 GB/T34750副猪嗜血杆菌检测方法GB 19489 实验室生物安全通用要求NY/T 541 兽医诊断样品采集、保存与运输技术规范
3术语和定义
下列术语和定义适用于本文件.
3.1
副猪格拉瑟菌Glaesserellaparasuis
副猪格拉瑟菌原属于巴氏杆菌科（Pasteurellacene），嗜血杆菌属（Haemophinus），因遗传特征差异被划归至新属，其分类地位现属于巴氏杆菌科（Pasteurellaceae），格拉瑟菌属（Glaesserella），故特说明副猪格拉瑟菌（Glaesserella parasuis）与副猪嗜血杆菌（Haemophilus parasuis）为同一种细菌.
4缩略语
下列缩略语适用于本文件.
CHCA:a-氰-4-羟基肉桂酸（a-Cyano-4-HydroxycinnamicAcid，CoH-NO）.
TSA：胰蛋白陈大豆琼脂（Trypticase SoyAgar）.
MALDI-TOF MS：基质辅助激光解析电离飞行时间质谱（Matrix-Assisted Laser Desorption/IonizationTime of Flight Mass Spectrometry ).
5原理
质量分析器），MALDI-TOFMS是近年来发展起来的一种新型软电离技术，原理是利用激光照射微生 MALDI-TOFMS主要由两部分组成：MALDI（基质辅助激光解析电离离子源）和TOF（飞行时间物标本与基质形成的共结晶体，基质吸收激光能量并传递给微生物所含生物分子，同时将质子转移到生物分子或从生物分子得到质子而使生物分子电离，电离后的生物分子进入真空管，由于在真空管飞行过 程没有外力作用，到达真空管顶端离子检测器的时间与其质量有关，即质量越大、飞行速度越慢，到达检测器的时间越长，按照质量/电荷（m/z）比值大小，将采集的数据与微生物指纹图谱库对照鉴定.
6试剂和材料
T/SHAAV 028-2025
除非有特殊说明，仅使用色谱级试剂，实验用水应符合GB/T6682的规定.6.1乙腊（Acetonitrile，CHsCN）.6.3三氟乙酸（Trifluoroacetic acid，CF;COOH）.6.4α-氰4-羟基肉桂酸（α-Cyano-4-Hydroxycinnamic Acid，CoH-NO）.6.6标准菌株：大肠埃希氏菌ATCC8739. 6.5TSA固体培养基：按照GB/T34750中A.1的规定执行.6.7样品靶板：适用于仪器的一次性或重复使用靶板.6.81μL接种环.
6.2无水乙醇（Ethanol，CH;CHOH）
6.9CHCA基质液：建议使用质谱仪配套的商品化CHCA基质液：也可参照以下方法配制，将乙、无水乙醇、水和三氟乙酸按33:33:33:1体积比例配制溶剂，加入CHCA充分溶解形成过饱和溶液，经10000xg离心1min后于低温冷藏柜中保存，使用时取上清.
7仪器与设备
7.1基质辅助激光解析电离飞行时间质谱仪.7.2二级生物安全柜.7.4微量可调移液器：0.5 μL~2 μL、10 μL~100 μL、20 μuL~200 μuL、100 μuL~1000 μL. 7.3二氧化碳培养箱或培养装置：36°℃±1℃，5%CO2.7.5离心机：最大离心力≥16000×g7.6旋涡震荡器. 7.7低温冷藏柜：2°℃~8℃
8操作步骤
8.1样品的采集
8.1.1样品应于猪死亡后2h内进行采集. 8.1.2使用无菌器械切取病死猪的心脏、肺脏等组织样品，每个组织样品至少采集总体积的1/4，包含眼观正常部位和可疑病变部位，单独置于无菌容器内.8.1.3使用无菌注射器抽取胸腹水、心包积液及关节积液等体液样品，每个体液样品采集1mL~2mL，8.1.4样品于低温冷藏柜保存，24h内送达实验室. 少于1mL的全部采集.
8.2分离培养
8.2.1组织样品：使用烧灼至适当温度的手术刀片对可疑病变部位的组织表面烧烙灭菌，于烧烙处无菌剪取组织块涂布在TSA固体培养基上，使用无菌接种环分区划线接种，置于二氧化碳培养箱或培养装置中培养24h-48 h.
8.2.2体液样品：吸取50uL加至TSA固体培养基，使用无菌接种环分区划线接种，置于二氧化碳培养箱或培养装置中培养24h-48h.
8.3点靶
8.3.2用微量可调移液器吸取1gLCHCA基质液覆盖在样品表面，室温下晾干.
8.4检测
8.4.1进样：将制备好的靶板置于质谱仪的板架并装入仪器中，待真空度稳定后即可进行检测.8.4.2校准：每次样品检测前对质谱仪进行校准，详见附录A，使校准后对大肠埃希氏菌ATCC8739鉴 定结果的置信水平达到99.9%或分值在2.00～3.00.8.4.3数据采集：运行仪器对数据进行采集和分析，并生成质谱图.
