猪流感病毒与北美株和欧洲株猪繁殖与呼 吸综合征病毒三重荧光RT-PCR检测方法
Triplex real time RT-PCR detection method for Swine influenza virus、North American and European porcine reproductive andrespiratorysyndrome virus
中国兽医协会 发布
猪流感病毒与北美株和欧洲株猪繁殖与呼吸综合征病毒三重荧光 RT-PCR检测方法
1范围
本文件规定了猪流感病毒与北美株和欧洲株猪繁殖与呼吸综合征病毒三重荧光RT-PCR检测方法操作规程.
本文件适用于猪流感病毒与北关株和欧洲株猪繁殖与呼吸综合征病毒的鉴别检测.
2规范性引用文件
下列文件中的内容通过文中的规范性引用面构成本文件必不可少的条款.其中，注日期的引用文件，仅该日期对应的版本适用于本文件：不注日期的引用文件，其最新版本（包括的修改单）适用于本文件.
GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法GB19489实验室生物安全通用要求NY/T541兽医诊断样品采集、保存与运输技术规范
3术语和定义
本文件没有需要界定的术语和定义.
4缩略语
下列缩略语适用于本文件.BHQ：黑洞淬灭基团（Black HoleQuencher）Cy5：花青素5（Cyanine5）FAM：6-羧基荧光素（6-Carboxyfluorescein） DEPC：焦碳酸二乙酯（Diethyl pyrocarbonate）HEX：六氯-6-甲基荧光素（6-Hexachlorofluorescein）PRRSV-EU：欧洲株猪繁殖与呼吸综合征病毒（European Porcine Respiratory and ReproductiveSyndrome Virus) PRRSV-NA：北关株猪繁殖与呼吸综合征病毒（North American Porcine Respiratory and ReproductiveSyndrome Virus)SIV：猪流感病毒（Swine Influenza Virus）
5仪器与设备
5.1多通道荧光PCR仪.
T/CVMA 278-2025
5.2生物安全柜.
5.3冰箱（2°℃~6°℃和-20°℃）.
5.4台式冷冻离心机.
5.5组织匀浆机.
5.6水浴锅或金属浴仪.
5.7涡器.
0001~00~00~001~ 1~0）8μL).
6试剂和耗材
6.1试剂
酶的容器分装.6.1.2商品化病毒总核酸提取试剂盒或其他病毒核酸提取试剂.6.1.3商品化荧光RT-PCR试剂盒：含一步法荧光RT-PCR反应混合液，反转录酶、DNA聚合酶等.6.1.4无水乙醇.6.1.575%乙醇.
6.1.1除非另有说明，所用试剂均为分析纯，试验用水符合GB/T6682的要求.试剂均用无核酸
6.2阳性对照
猪流感病毒体外转录的非感染性RNA片段、北关株和欧洲株猪繁殖与呼吸综合征病毒体外转录的非感染性RNA片段，片段序列见附录A.也可以使用其他经过确认的阳性质控品.
6.3阴性对照
猪流感病毒阴性样品、北关株和欧洲株猪繁殖与呼吸综合征病毒阴性样品.
6.4引物和探针序列
引物和探针序列见附录B.
7生物安全要求
样品处理和核酸提取以及废弃物处理按照GB19489规定，在相应等级的生物安全实验室或者生物安全柜中进行，并做好个人防护.
8样品采集和处理
病料采集和处理应按照NY/T541有关规定进行，可以采集动物血液、组织、鼻拭子和肛拭子等.
9病毒核酸提取
病毒核酸提取见附录C.
9.1样品采集
按照NY/T541规定进行样品的采集和处理.无菌注射器静脉采血，不少于2mL，用自然析出法分离血清后，置于无菌血清管中.血清清亮，无溶血，无污染.
9.2血清样品的保存与运输
按照NY/T541规定进行血清样品的存放与运输.血清样品置2°C~8C条件下保存.若超过一周检测，置于-20℃以下冷冻保存.
10荧光RT-PCR反应
10.1荧光RT-PCR反应体系
多重荧光RT-PCR反应体系组成见附录D.1.单重荧光RT-PCR反应体系组成见附录D.2.
10.2荧光RT-PCR反应程序
荧光RT-PCR反应程序见附录D.3.
10.3结果描述及判定
10.3.1试验成立条件
阳性对照（FAM、Cy5和HEX）均出现S形扩增曲线且Ct值≤30，阴性对照和空白对照（FAM、Cy5和HEX）均无扩增曲线且Ct≥40或者无值.满足此条件，视为此次试验有效.
10.3.2结果判定和鉴别
10.3.2.1有典型扩增曲线且Ct≤35，判定为核酸检测阳性：
10.3.2.2有扩增曲线但35<Ct<40，属于疑似区间，需要重新确认，建议使用单重荧光RT-PCR方法确认：如果Ct值仍然<40，则判定为核酸检测阳性，如果Ct值≥40或者无Ct值，判定为核酸检测阴性. 10.3.2.3没有扩增曲线，或者Ct≥40，判定为核酸检测阴性. 10.3.2.4FAM阳性荧光信号表示PRRSV-NA核酸检测阳性，Cy5阳性荧光信号表示SIV核酸检测阳性，HEX阳性荧光信号表示PRRSV-EU核酸检测阳性：两种阳性荧光信号表示对应的其中两种病毒核酸检测阳性，三种阳性荧光信号表示SIV、PRRSV-NA和PRRSV-EU三种病毒核酸检测阳性，结果鉴别见表1. 表1结果鉴别 荧光信号阴阳性 病毒核酸检测结果FAM ( ) Cy5 ( ) PRRSV-NA核酸检测阳性 SIV核酸检测阳性
