中华人民共和国国家标准
GB 15193.28-2020
食品安全国家标准
体外哺乳类细胞微核试验
国家市场监督管理总局 中华人民共和国国家卫生健康委员会 发布
食品安全国家标准
体外哺乳类细胞微核试验
1范围
本标准规定了体外哺乳类细胞微核试验的基本试验方法和技术要求.本标准适用于评价受试物的遗传毒性作用.
2术语和定义
2.1微核
细胞有丝分裂后期染色体有规律地进人子细胞形成细胞核时，仍留在细胞质中的整条染色单体或染色体的无着丝断片或环，在末期单独形成一个或儿个规则的次核，被包含在细胞的胞质内面形成，
2.2着丝粒
在细胞分裂期染色体与纺锤体纤维连接的区域，以使子染色体有序移动到子细胞两极.
2.3非整倍体
二倍体染色体组中缺少或额外增加一条或若干条完整的染色体的变异类型.
2.4非整倍体诱变剂
作用于细胞有丝分裂或者减数分裂周期，导致细胞分裂异常，诱发非整倍体的物质.
2.5染色体断裂
染色体臂出现长度大于染色体臂宽度的裂隙.
2.6染色体断裂剂
引起染色体发生断裂的物质.
2.7组胞毒性
对细胞结构或功能的有害效应，最终可导致细胞死亡.
3试验目的和原理
体外哺乳类细胞微核试验是一种用于检测哺乳类细胞在受试物处理后是否产生微核的遗传毒性检测方法，本方法适用于检测有丝分裂细胞暴露于受试物期间或之后致染色体断裂和诱发非整倍体的能 力.如果3h～6h短期处理的试验结果为阴性或不明确时，需要进行无代谢活化系统的长期处理试验，相当于用受试物处理细胞1.5个~2.0个正常细胞周期.
4仪器和试剂
4.1仪器
细胞培养箱、倒置显微镜、正置显微镜、超净台、离心机.
4.2培养液
根据细胞类型来选择适宜的培养基.对于V79、CHL或CHO细胞，常用MEM（Eagle)培养液加人10%胎牛血清和适量抗菌素（可用青霉素100IU/mL.链霉素100μg/mL）.对于L5178Y或TK6细胞. 常用RPMI1640培养液加人10%马血清和适量抗菌素（可用青霉素100IU/mL链霉素100μg/mL）.
4.3代谢活化系统
4.3.1S9辅助因子的配制
4.3.1.1镁钾溶液
氯化镁1.9g和氯化钾6.15g加蒸馏水溶解至100mL.
4.3.1.20.2mol/L磷酸盐缓冲液（pH7.4)
至7.4 0.103 MPa20 min灭菌或滤菌.
4.3.1.3辅酶-Ⅱ（氧化型）溶液
无菌条件下称取辅酶-Ⅱl，用无菌蒸馏水溶解配制成0.025mol/L溶液，现用现配.
4.3.1.4葡萄糖-6-磷酸钠盐溶液
称取葡萄糖-6-磷酸钠盐，用蒸馏水溶解配制成0.05mol/L溶液，过滤灭菌.现用现配.
4.3.2大鼠肝S9组分的诱导和配制
选健康雄性成年SD或Wistar大鼠体重150g~200g，约5周龄~6周龄.将多氯联苯（Aroclor1254）溶于玉米油中，浓度为200g/L，按500mg/kg体重无菌操作一次腹腔注射，5d后处死动物，处死前禁食12h.
也可采用苯巴比妥钠和β萘黄酮联合诱导的方法进行制备经口淮胃给予大鼠苯巴比妥钠和β萘黄酮，剂量均为80mg/kg体重，连续3d禁食16h后断头处死动物.其他操作同多氯联苯诱导.
处死动物后取出肝脏，称重后用新鲜冰冷的0.15mol/L氯化钾溶液连续冲洗肝脏数次，以便除去能抑制微粒体酶活性的血红蛋白.每克肝（湿重）加0.1mol/L氯化钾溶液3mL，连同烧杯移入冰浴中，用消毒剪刀剪碎肝脏，在玻璃匀浆器（低于4000r/min，1min~2min）或组织匀浆器（低于20000r/min，1min）中制成肝匀浆，以上操作需注意无菌和局部冷环境.
将制成的肝匀浆在低温（0℃～4℃）高速离心机上以9000g离心10min，吸出上清液为S9组分，分装于无菌冷冻管中，每管2mL左右，最好用液氮或干冰速冻后置一80℃C低温保存.
S9组分制成后，经无菌检查测定蛋白含量（Lowry法），每毫升蛋白含量不超过40mg为宜，并经间接致突变剂鉴定其生物活性合格后贮存于一80℃低温或冰冻干燥，保存期不超过1年.
4.3.3S9混合液的制备
S9混合液浓度一般为1%～10%，实际使用浓度可由各实验室决定，但需对其活性进行鉴定，必须能明显活化阳性对照物，且对细胞无明显毒性.
一般由S9组分和辅助因子按1：9组成10%的S9混合液，无菌现用现配，10%S9混合液10mL配制方法如下：取上述磷酸盐缓冲液6.0mL、镁钾溶液0.4mL、葡萄糖-6-磷酸钠盐溶液1.0mL、辅酶-Ⅱ溶液1.6mL、肝S9组分1.0mL，混匀，置冰浴中待用.
4.4肌动蛋白聚合抑制剂细胞松弛索B（CytochalasinB.cytoB）溶液
用二甲基亚祺（DMSO）配制适当浓度的储备液，避光冷藏保存.cytoB的终浓度通常为3μg/mL～6μg/mL，实验室应根据各种细胞系选择cytoB的适当终浓度，以达到理想的双核细胞出现频率.
4.50.075mol/L氯化钾溶液
5.59g氯化钾加蒸馏水至1000mL.
4.6固定液
甲醇：冰醋酸为311.临用前配制.
4.7姬姆萨（Giemsa）染液
取姬姆萨染料3.8g，置乳钵中，加少量甲醇研磨.逐渐加甲醇至375mL.待完全溶解后，再加125mL甘油，放人37℃温箱中保温48h.保温期间振摇数次，使充分溶解.取出过滤，2周后使用，作为姬姆萨染液原液，使用时，取1份姬娜萨染液原液，与9份1/15mol/L磷酸盐缓冲液（pH6.8）混 合，配成其应用液，现配现用.
磷酸盐缓冲液（1/15mol/L，pH6.8）配制方法如下：
a）第一液：取磷酸氢二钠（NaHPO）9.47g溶于1000mL去离子水中，配成1/15mol/L溶液；b）第二液：取磷酸二氢钾（KH;PO）9.07g溶于1000mL去离子水中，配成1/15mol/L溶液；
5试验方法
5.1受试物
度使用，受试物应无菌现用现配，否则须确认储存不影响其稳定性. 固体受试物应溶解于适合的溶媒中，并稀释至适当浓度.液体受试物可直接使用或稀释至适当浓
5.2细胞
周血淋巴细胞株（如TK6）和原代培养细胞.推荐使用CHL或L5178Y细胞株.细胞在使用前应进行 可选用中国仓鼠肺细胞株（V79、CHL）或卵巢细胞株（CHO）、小鼠淋巴瘤细胞株（L5178Y）、人外染色体数目稳定性和有无支原体污染的检查.
5.3试验方案选择
然后观察分析已完成一次有丝分裂的细胞（双核细胞）微核率.当选用人类淋巴细胞时，建议采用方案 试验分为使用和不使用cytoB两种方案.方案一：在细胞经过受试物处理，有丝分裂前使用cytoB，一，因为不同来源的细胞周期不同，而且不是的细胞都对植物血球凝集素（PHA）有反应.方案二：
不使用cytoB，细胞经过受试物处理后观察分析细胞微核率，如果有证据表明受试物干扰cytoB的活性，或cytoB可能影响细胞的生长（如小鼠淋巴瘤细胞株），建议采用方案二，
5.4剂量
5.4.1剂量设置
至少应设置3个检测剂量，受试物没有细胞毒性时，从最高剂量往下设至少2个剂量，一般情况下间隔系数可为2~3；有细胞毒性时，其剂量范围应涵盖从55%土5%的细胞毒性到儿乎无细胞毒性.
5.4.2最高剂量的选择
决定最高剂量的因素是细胞毒性、受试物的溶解度以及pH、渗透压.
受试物有细胞毒性时，最高剂量应能引起55%土5%的细胞毒性：如果没有细胞毒性或沉淀，最高剂量应是5μL/mL、5mg/mL或10mmol/L.
对溶解度较低的物质，当达到最大溶解浓度时仍无毒性，则最高剂量应是在最终培养液中溶解度限能影响观察. 值以上的一个浓度.在某些情况下，应使用一个以上可见沉淀的浓度，溶解性可用肉眼鉴别，但沉淀不
5.4.3细胞毒性的确定
在S9存在和不存在两种条件下依据细胞完整性和生长情况的指标来确定细胞毒性.
指数 (Cytokinesis Block Proliferation Index CBPI) . 方案一，使用cytoB，细胞毒性的确定可依据复制指数（ReplicationIndex，RI）或胞质分裂阻断增殖
式中：
C阴性对照组.
细胞毒性=100-RI
式中：
CBPI=1时等同于100%细胞生长抑制；
500细胞总数.
式中：
T-受试物组；
C-阴性对照组.
方案二，不使用cytoB，细胞毒性的确定可依据相对细胞增长数（Relative Increase in Cell Counts，RICC）或相对增殖倍数（Relative Population Doubling，RPD).
受试物组细胞数的增加（试验后一试验前）
细胞毒性=100-RICC
