中华人民共和国国家标准
GB4789.44-2020
食品安全国家标准
食品微生物学检验 创伤弧菌检验
中华人民共和国国家卫生健康委员会 国家市场监督管理总局 发布
食品安全国家标准
食品微生物学检验创伤弧菌检验
1范围
本标准规定了水产品中创伤弧菌（Vibriozalrificus）的检验方法.本标准适用于鱼、虾、蟹、贝类等水产品中创伤弧菌的检验.
2设备和材料
除微生物实验室常规灭菌及培养设备外，其他设备和材料如下：2.1恒湿培养箱：36℃土1℃.2.2冰箱：2C~5℃C、7℃~10℃. 2.3恒湿水浴锅.2.4均质器或无菌研钵.2.5天平：感量0.1g.2.6 PCR仪.2.7电泳仪或毛细管电泳仪. 2.8凝胶电泳成像系统或紫外检测仪.2.9生物安全柜.2.10高速离心机（最大转速至少15000r/min）.2.12微量可调移液器（量程2.5μL、10μL、100μL、1000μL）及配套吸头. 2.11涡旋振荡器.2.13精密pH试纸或pH计.2.14 1无菌试管：规格18mm×180mm和15mm×100mm.2.15 5无菌吸管：规格1mL（具0.01mL刻度）和10mL（具0.1mL刻度）.2.17无菌培养Ⅲ；直径90mm. 2.16无菌锥形瓶：容量250mL、500mL和1000mL.2.18无菌手术剪、镊子、钳子等.2.19PCR反应管.
3培养基和试剂
3.1蛋白陈-氯化钠-纤维二糖-多黏菌素E（PNCC）增菌液：见A.1.3.2纤维二糖-多黏菌素E（CC）琼脂培养基：见A.2.3.3改良纤维二糖-多黏菌素B-多黏菌素E（mCPC）琼脂培养基：见A.3.3.43%氯化钠胰蛋白陈大豆琼脂培养基：见A.4. 3.5磷酸盐缓冲液（PBS）：见A.5.3.63%氯化钠三糖铁琼脂斜面：见A.6.
3.7嗜盐性试验培养基：见A.7.3.83%氯化钠赖氨酸脱羧酶试验培养基：见A.8.3.93%氯化钠MR-VP培养基：见A.9. 3.103%氯化钠溶液：见A.10.3.11 氧化酶试剂：见A.11.3.12 革兰氏染色液：见A.12.3.13 Voges-Proskauer(V-P)试剂：见A.14. 邻硝基酚-β-D-半乳糖苷（ONPG）试剂：见A.13.3.14 3.15 细菌DNA提取试剂盒.3.16 生化鉴定试剂盒.3.17 PCR反应配套试剂.3.18 琼脂糖凝胶电泳配套试剂.3.19 9具有菌种保藏资质单位提供的创伤弧菌标准菌株.
4检验程序
创伤弧菌检验程序见图1.
图1创伤弧菌检验程序
5操作步骤
5.1样品制备
5.1.1新鲜样品采集后应于3h内完成检验，若不能在规定时间内完成，则将样品置于7℃~10℃条 件下保存（因创伤弧菌在4℃条件下极易形成活面不可培养的状态，因此样品勿放4℃条件下），并尽可能在24h内完成检验：冷冻样品应在不超过45℃的温热条件下解冻，解冻时间不超过15min.
5.1.2取样：鱼类和头足类取其表面组织、肠和鳃.贝类则取全部内容物（包括贝肉和体液）.甲壳类取整个动物或其中心部分（包括肠和鲲），如为带壳贝类或硬壳甲壳类，则应先用流动自来水冲洗外壳 并用滤纸吸干表面水分，然后无菌操作打开外壳，按上述要求取相应部分.
5.1.3以无菌操作取上述处理后的样品25g，加人PNCC增菌液225mL，用旋转刀片式均质器以8000r/min均质1min，或用拍击式均质器均质2min，充分混匀制备成1：10的样品匀液.如无均质器，则将样品放人无菌乳中充分研磨，取磨碎后的样品25g转人500mL无菌锥形瓶中，加人PNCC增菌液225mL，充分振荡混匀，制备成1：10的样品匀液.
5.2增菌
5.3PCR检测
PCR实验环境条件和过程控制应参照GB/T27403《实验室质量控制规范食品分子生物学检测》规定执行，下同.
5.3.1DNA模板的制备
在距离PNCC增菌液的液面下1cm处吸取1mL置于1.5mLEP管中，9000r/min离心3min，弃去上清液.向沉淀中加人1mLPBS将其悬浮并充分清洗后，9000r/min离心3min，弃去上清液，按此步骤反复清洗沉淀2次～3次，弃去最后一遍上清液，加人1mL无菌超纯水，100C煮沸10min，继而12000r/min离心5min，上清液用于PCR分析.若不能及时分析则于一20℃保存备用.
也可以用商品化的DNA提取试剂盒按其说明书要求提取制备DNA模板.
5.3.2PCR扩增
5.3.2.1引物
信息见表1.
表1创伤弧菌PCR检测用引物信息
引物 序列voA A-785F 5′ CCG CGG TAC AGG TTG GOG CA 3' 扩增片段长度/bp A-1303R 5′ CGC CAC CCA CTT TCG GGC C 3 519
5.3.2.2对照设置
每次PCR反应使用创伤弧菌标准菌株作为阳性对照，同时，使用除创伤弧菌之外的其他弧菌的标准菌株作为阴性对照，以灭菌去离子水作为空白对照.
5.3.2.3PCR反应体系
见表2.
表2创伤弧菌PCR检测反应体系组成
试剂 反应体积/L无菌超纯水 13.710× PCR缓冲液 2 525 mmol/1. MgC1; 2 52 5 mmol/L dNTP 2 0上游引物(10 μmol/ L) 1 0上游引物(10 μmol/L) 1 0DNA模板 2 05 U/yxl. Taq 总体积 25.0 0 3
5.3.2.4PCR反应程序
伸：72C、10min：电泳检测.若不能立即检测则4C保存备用. 预变性：94℃、5min；变性：94C、1min；退火：62C、1min:延伸：72℃、1min:循环数：30：终延
5.3.3电泳
凝胶电泳检测PCR扩增产物.用0.5×TBE缓冲液配制1.5%的琼脂糖凝胶（含EB0.5μg/mL或Goldview5μL/100mL或Gelred 5 yL/50mL等DNA染料），取5μLPCR扩增产物与1 μL6×核酸 电泳上样缓冲液混合后，点样，同时有一孔加人DNA分子量标准（范围为100bp~1000bp）.根据以下公式：电泳槽正负极的距离（cm）×5V/cm计算并设置电压，使用0.5×TBE缓冲液恒压电泳，根据溴酚蓝的移动位置确定电泳时间，使用凝胶成像系统或紫外检测仪观察和记录结果.
5.3.4结果判定
质控系统：阴性对照和空白对照均未出现扩增条带，阳性对照出现预期大小（519bp）的扩增条带，则检测系统正常，否则，任一种对照如果出现非上述正常结果，应重做实验，同时排除污染因素.
阳性结果：在质控系统正常的情况下，待测样品出现预期大小（519bp）的扩增条带，判定PCR结果为阳性.
阴性结果：在质控系统正常的情况下，待测样品未出现预期大小（519bp）的扩增条带，判定PCR结果为阴性.
5.4分离
用10pL接种环在距离PNCC增菌液的液面下1cm沾取一环增菌液，分别划线接种于CC和圆形、扁平，光照下呈透明或中心不透明但边缘透明的黄色至橘黄色菌落，菌落直径1mm～2mm，菌 mCPC平板，于36℃±1C条件下培养18h±1h.典型的创伤弧菌在CC和mCPC平板上的形态为：落周围可出现（或不出现）黄色晕圈.
