中华人民共和国出入境检验检疫行业标准
SN/T3536.2-2017
出口食品中酸性橙Ⅱ号的检测方法 第2部分：液相色谱-质谱/质谱法
Determination of acid orangeIin food for export-Part 2:LC-MS/MSmethod
国家质量监督检验检疫总局 中华人民共和国 发布
前言
本部分是SN/T3536《出口食品中酸性橙Ⅱ号的检测方法》的第2部分.本部分按照GB/T1.1-2009给出的规则起草本部分起草单位：中国检验检疫科学研究院、中华人民共和国黑龙江出人境检验检疫局. 本部分由中华人民共和国国家认证认可监督管理委员会提出并归口.本部分主要起草人：陈冬东、姜冰、刘永、吴博隆、吴岩.
出口食品中酸性橙Ⅱ号的检测方法 第2部分：液相色谱-质谱/质谱法
1范围
SN/T3536的本部分规定了食品中酸性橙Ⅱ号检测的液相色谱-质谱/质谱法. 本部分适用于枣糕、黄鱼、柑橘、橙汁、熏肠、红瓜子、火锅底料、辣椒碎、小米、红枣酸奶及腐竹中酸性橙Ⅱ号的检测和确证.
2规范性引用文件
下列文件对于本文件的应用是必不可少的.凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件.凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括的修改单）适用于本文件.
GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法
3方法提要
试样中的酸性橙Ⅱ号用乙晴匀浆提取，经弱阴离子小柱（WAX）弱阴离子交换固相萃取柱净化后，用液相色谱-质谱/质谱法测定和确证，外标法定量.
4试剂与材料
除非另有说明外，所用试剂均为分析纯，水为GB/T6682规定的一级水.
4.1乙睛：色谱纯，4.2甲醇：色谱纯.4.3氨水：含量为25%~28%4.6氯化钠. 4.5乙酸铵.4.7无水硫酸钠：经650C灼烧4h，冷却后在干燥器中储存备用.4.8无水硫酸钠柱：用内径约为1.5cm的下部收口玻璃管，收口处填装少量玻璃棉，然后填装无水硫酸钠，高度约为1.5cm左右.4.9乙酸铵溶液（5mmol/L）：准确称取0.193g乙酸铵于500mL容量瓶中，用水溶解并定容至刻度，混匀后备用.容至刻度，混匀后冰乙酸（4.4）调至pH=4，备用.4.115mmol/L乙酸铵-乙晴（7030，体积比）溶液：量取70mL乙酸铵溶液（4.9）.用乙（4.1）稀释4.125%氨水-甲醇溶液：量取5mL氨水（4.3），用甲醇（4.2）定容至100mL. 至100ml.
4.4冰乙酸.
SN/T 3536.2-2017
4.13弱阴离子固相萃取（SPE）柱：60mg.3mL或性能相当者.使用前依次用3mL甲醇、3mL乙酸铵溶液（4.10）活化.
4.14酸性橙Ⅱ号标准物质：CHNNaO S.CAS号633-96-5，纯度大于或等于99.0%
4.15酸性橙Ⅱ号标准储备溶液：准确称取0.0100g酸性橙Ⅱ号标准品至100mL容量瓶中，用乙睛（4.1）配制成浓度为100pg/mL的标准储备液，标准储备液可在一18℃条件下储存6个月.
4.16酸性橙Ⅱ号标准工作溶液：分别准确移取一定体积的标准储备溶液，根据需要用5mmol/L乙酸铵-乙晴（4 11）稀释成50ng/mL 100ng/mL，150ng/mL 200ng/mL 250ng/mL的标准工作溶液，0℃~4℃冰箱保存，有效期为一周.
4.17微孔滤膜：0.22μm，有机系.
5仪器和设备
5.1液相色谱-质谱/质谱（LC-MS/MS）仅：配有电喷雾离子源（ESI
5.2分析天平：感量分别为0.0001g和0.01g
5.3固相萃取装置.
5.5氮吹仪.
5.6旋涡混匀器.
5.7组织碎机.
5.8均质器：转速不低于10000r/min.
5.9离心机：转速不低于4000r/min
6试样的制备与保存
6.1试样制备
6.1.1橙汁、酸奶
取代表性样品约500g，混匀，装人洁净容器，密封并标明标识.
6.1.2枣糕、熏肠、火锅底料、辣椒碎、小米、腐竹
取代表性样品约500g，取可食部分，经粉碎机粉碎，混匀，装入洁净容器，密封并标明标识.
6.1.3黄鱼、柑橘、红瓜子
将黄鱼、柑橘和红瓜子样品或去皮、壳、骨等（不可用水洗涤），取可食部分约500g，切碎或经粉碎机粉碎，混匀，装人洁净容器，密封并标明标识.
6.2试样保存
枣糕、橙汁、红瓜子、辣椒碎、小米、酸奶和腐竹试样可于0℃～4C保存，黄鱼、柑橘、熏肠和火锅底料试样于一18℃冷冻保存.
在抽样和制样操作过程中，应防止样品受到污染或发生含量的变化.
7测定步骤
7.1提取
称取5g（精确到0.01g）均匀试样，置于50mL具塞离心管中，加人5g氯化钠（4.6）和20.0mL乙晴（4.1）.均质提取1min.4000r/min离心5min.将上层清液过无水硫酸钠柱（4.8）于100mL浓缩瓶转蒸发浓缩至近干.再用氮气流吹干，用2mL20mmol/L乙酸铵溶液（4.10）溶解浓缩瓶中残渣待 中.下层及残渣再用20mL乙晴（4.1）重复提取一次，合并提取液于同一浓缩瓶中，在40C水浴中用旋净化.
7.2净化
2mL/min，再分别用2mL及1mL20mmol/L乙酸铵溶液（4.10）洗涤浓缩瓶，过固相萃取柱，弃去流 将上述待净化液全部转移至经过预活化的璃阴离子固相萃取柱（413）中，控制流速在1mL/min~出液.依次用3mL水、1mL甲醇淋洗固相萃取柱，最后用3mL5%氨水-甲醇溶液（4.12）洗脱，控制流速在1mL/min~2mL/min，收集洗脱液于15ml.刻度离心管中，洗脱液经40C氮气仪吹干后，用1.00mL5mmol/L乙酸铵-乙睛溶液（4.11）振荡溶解残渣后过0.22μm滤膜后，供液相色谱-质谱/质谱测定.
7.3基质标准工作溶液的制备
取空白样品，按7.1和7.2操作至“洗脱液经40C氮气仪欧干后”，加人1.00mL浓度分别为50ng/mL，100ng/mL.150ng/mL200ng/mL.250ng/mL的标准工作液，经0.22μm滤膜过滤，供液相色谱-质谱/质谱测定.
7.4液相色谱-质谱/质谱条件
液相色谱-质谱/质谱条件如下：
a）色谱柱；ACQUITYUPLCCHMBEHC1.7gm2.1mm（内径）X50mm，或相当者；b）流动相：A乙腊，B5mmol/L乙酸铵溶液，梯度洗脱程序参见表A.1：c）流速：0.25mL/min;d）柱温：30C：f）离子方式：电喷雾电离（ESI），负离子： e）进样量：5pL；g）扫描方式：多反应监测（MRM）：h）质诺/质谱参考条件参见表A.1和表A.2.
7.5液相色谱-质谱/质谱检测
在仪器最佳工作条件下，对基质标准工作液和样液进行测定，外标法定量，样液中待分析物的响应值均应在仪器测定的线性范围内，若超出线性范围应适当稀释，同时用相同稀释倍数的基质标准工作液进行定量.样品基质对标准工作液有一定影响，建议样品处理后尽快检测.
7.6液相色谱-质谱/质谱确证
如果样液与标准工作溶液的质量色谱图中，在相同保留时间有色谱峰出现，允许偏差小于士2.5%，
