中华人民共和国出入境检验检疫行业标准
SN/T 4453-2016
出口食品中金黄色葡萄球菌的分子分型 SPA基因分型方法
Molecular typingmethod of Staphylococcus aureus in export foodSPA typingmethod
中华人民共和国 国家质量监督检验检疫总局 发布
前言
本标准按照GB/T1.1-2009给出的规则起草.
请注意本文件的某些内容可能涉及专利.本文件的发布机构不承担识别这些专利的责任.
本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口.
本标准起草单位：深圳市检验检疫科学研究院、中华人民共和国深圳出人境检验检疫局、中华人民共和国江苏出人境检验检疫局.
本标准主要起草人：赵芳、洪小柳、刘慧玲、黄李华、吕敬章、葛丽雅、张恒、马液棉、黄欣迪、蒋原、薛峰、闫笑梅、张欢.
出口食品中金黄色葡萄球菌的分子分型 SPA基因分型方法
1范围
本标准规定了金黄色葡萄球菌的SPA基因分型方法.
本标准适用于金黄色葡萄球菌的SPA基因分型
2规范性引用文件
下列文件对于本文件的应用是必不可少的.凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件.凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括的修改单）适用于本文件.
GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法 GB4789.10食品安全国家标准食品微生物学检验 金黄色葡萄球菌检验GB19489实验室生物安全通用要求GB/T27403实验室质量控制规范食品分子生物学检测
3缩略语
下列缩略语适用于本文件，
CTAB十六烷基三甲基溴化胺（Hexadecylurimethylammonium Bromide)DNA脱氧核糖核酸（Deoxyribonucleeacid） dNTP脱氧核糖核苷三磷酸（deoxy -ribonucleosideEDTA乙二胺四乙酸（ethylene dinminetetraacetit acid） triphosphate)PCR聚合酶链反应（polym crase.ch action)SDS 十二烷基硫酸钠（sodiumdodecylsulfate）SPA Taq 酶DNA聚合酶 葡萄球菌A蛋白（Staph ylococcus protein A)Tris 三（羟甲基）氨基甲烷（tris hydroxymethyl aminomethane）
4原理
SPA是葡萄球菌细胞壁的一种表面蛋白，绝大多数金黄色葡萄球菌均含有SPA.编码SPA基因的X区包含有2个~15个长21bp~27bP的重复序列，该区由于重复序列数目、重复序列特征及重复序列的排列顺序不同而具有高度的多态性.SPA基因的X区具有良好的重复性和体内、体外稳定性，适合用来基因分型.根据SPA基因序列设计引物对X区进行扩增，将扩增产物的测序结果进行比对 分析，从而达到分型的目的.
5试剂和材料
除另有规定外，试剂为分析纯或生化试剂.实验用水符合GB/T6682的要求.试剂均用
SN/T 4453-2016
无DNA酶污染的容器分装，5.1DNA提取试剂：称取0.1gchelex100粉末，加人100mL灭菌蒸馏水，摇匀即可.5.2RNase（核糖核酸酶）溶液（20mg/mL）.5.4TE 缓液：10 mmol/L Tris-HC1(pH 8.0)，1 mmol/L EDTA(pH 8.0).5.5蛋白酶k溶液（25mg/mL）.5.6NaCl（氯化钠）溶液（5mol/L）5.7三氯甲烷（氯仿）. 5.8酚.5.9异戊醇.5.10异丙醇.5.1110×PCR缓冲液：200mmol/LTris-HCI(pH8.0），200mmol/L氯化钾.5.12琼脂糖. 5.13DNA分子量标记物（100bp~1000bp）.5.14血琼脂平板：见A.3.5.15CTAB-NaCI溶液：见A.1.5.16无菌生理盐水：见A.2.
5.3葡萄球菌溶菌酶溶液（1mg/mL）.
6仪器和设备
6.2DNA测序仪.6.5电热仪，6.6离心机：离心力不小于12000g. 6.7恒温培养箱：36C±2℃.6.8移液器：2μl~10μl、10μL~100μL、20L~200pL、100μL~1000μL
6.1PCR仪.
6.3电泳装置.
6.4凝胶成像系统.
7检测步骤
7.1样品制备、增菌培养和分离
样品的制备、增菌培养和分离步骤参照GB4789.10方法进行.
7.2模版DNA的制备
7.2.1直接提取法
金黄色葡萄球菌经培养后，取增菌液1mL.加到1.5mL无菌离心管中，13000r/min离心5min，吸弃上清：加人50μLDNA提取液，混匀后沸水浴5min，13000r/min离心5min，取上清保存于 -20C备用以待检测.对分离到的菌落，可直接挑取加人50gLDNA提取液，再按照上述步骤制备模版DNA以待检测.
7.2.2CTAB法
金黄色葡萄球菌在血平板上36C过夜培养后，挑取菌落用无菌生理盐水比浊到0.5麦氏单位；
13000r/min离心5min，吸弃上清；加人280μlTE缓冲液、2.5μLRNase和50μL的葡萄球菌溶菌酶，36C温育1h；加人30pL 10%SDS、2.5pL RNase和4μL蛋白酶k，36C温育1 h；加人100μL5min；将上层液转移到新的管中，等体积的酚：氯仿：异戊醇（体积比为：25：24：1）抽提两次，随后等 NaCI溶液和80μl.CTAB-NaCl溶液，65C温育10min：加人等体积的氰仿混匀，13000r/min离心体积氯仿：异戊醇（体积比为：24：1）抽提一次；吸取上层液到新管中，加人500pL异丙醇沉淀DNA，室温放置20min，13000r/min离心10min，吸弃上清液：加人1mL70%乙醇溶液，13000r/min离心5min，吸弃上清，加入50pLTE缓冲渡溶解DNA，立即使用或保存于-20℃C冰箱备用.
也可使用等效的商业化的DNA提取试剂盒并按其说明制备模版DNA.
7.3PCR扩增
7.3.1PCR扩增和测序引物序列
正向引物：5'-TAAAGACGATCCTTCGGTGAGC-3';反向引物：5'-CAGCAGTAGTGCCGTTTGCTT-3′
7.3.2PCR反应体系
见表1.
表1PCR反应体系
试剂 贮备液浓度 加样体积/L 终浓度双蒸水 补至5010×PCR缓冲液 5Mg'* 25 mmol/L 3 1.5 mmol/L dNTP 2.5 mmol/L 4 0.18 mmol/L上游引物 10 μmol/L 0.5 0.04 μmol/L 0 04 μmol/ LTaqg 10 μmol/L 5 U/μL 0 5 0 5 0 05 U/μL模板DNA 2注1：反应体系中各试剂的量可根据其体情况或不同的反应总体积进行适当调整.注2：每个反应体系应设置两个平行反应.
7.3.3反应条件
94C预变性5min：94C变性30s，55C退火1min，72C延伸30s，35个循环；72℃延伸10min4C保存反应产物.
注：PCR反应参数也可根据基因扩增仪型号的不同进行适当的调整.
7.4电泳及DNA测序
行点样，用DNA分子量标记物做参照，100V恒压电冰，电冰20min～40min，使用凝胶成像系统观察 结果.观察到单一条带的PCR扩增产物，用相应测序引物进行双向测序.
