中华人民共和国出入境检验检疫行业标准
SN/T 4525.10-2016
出口食品中致病菌的分子分型 MLST方法 第10部分：小肠结肠炎耶尔森氏菌
Multilocus sequence typing detection method for pathogens in export foodPart10:Yersinia enterocolitica
中华人民共和国 国家质量监督检验检疫总局 发布
前言
SN/T4525《出口食品中致病菌的分子分型MLST方法》共分10个部分：
第1部分：沙门氏菌： 第2部分：金黄色葡萄球菌；第3部分：副溶血性弧菌：第4部分：霍乱弧菌：第5部分：克罗诺杆菌：第7部分：空肠弯曲菌； 第6部分：化脓链球菌：第8部分：致泻性大肠埃希氏菌：第9部分：单核细胞增生李斯特氏菌：第10部分：小肠结肠炎耶尔森氏菌.本部分为SN/T4525的第10部分 本部分按照GB/T1.1-2009给出的规则起草.请注意本文件的某些内容可能涉及专利.本文件的发布机构不承担识别这些专利的责任.本部分由国家认证认可监督管理委员会提出并归口.本部分起草单位：中国检验检疫科学研究院、中华人民共和国江苏出人境检验检疫局、中华人民共和国南京出人境检验检疫局.
本部分主要起草人：陈颖、王婷、赵晓燕、蒋原、薛峰、赵晓美.
出口食品中致病菌的分子分型
MLST方法
第10部分：小肠结肠炎耶尔森氏菌
1范围
SN/T4525的本部分规定了出口食品中小肠结炎耶尔森氏菌的 分子分型MLST检测方法.本部分适用于出口食品中小肠结肠炎耶尔森氏菌的分子分型检测
2规范性引用文件
下列文件对于本文件的应用是必不可少的.凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件.凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所值的修改单）适用于本文件.
GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法
3术语和定义、缩略语
3.1术语和定义
下列术语和定义适用于本文件3.1.1
管家基因house-kceping gene
细胞中均要表达的一类基因其产物是对维持细胞基本生 命活动所必需的，其基因序列高度保守并且在大多数情况下持续表达.又称看家基因，持家基因
3.1.2
Taq DNA 高Thermus aquaricus DNA polymerase
从Thermus aqmaricus 细菌中提取的耐热DNA聚合酶.
3.2缩略语
下列缩略语适用于本文件.dNTP：脱氧核糖核苷三磷酸（dcoxy-ribonucleoside triphosphate）EDTA;乙二胺四乙酸（Ethylene Diamine Tetraacetie Acid)MLST;多位点序列分型(multilocus sequence typing)ST；序列型（Sequence Type) Tris：三（羟甲基）氨基甲烷[tris（hydroxymethyl）aminomethane]
4原理
号，不同的菌株对应不同的序列型，从面揭示菌株间等位基因的多样性.MLST分型中多个管家基因 MLST是通过测定多个管家基因中长度约为470bp核心片段的核苷酸序列，对其组合进行索引编的序列分析比较在实验过程的操作性与结果的可靠性之间取得了平衡，且结果准确，所得数据在不同的实验室间具有良好的可比性.
5试剂和材料
除有特殊说明外，实验用试剂均为分析纯或生化试剂：实验用水符合GB/T6682中一级水的要求.试剂均用无DNA酶污染的容器分装.
5.1ExTaqDNA聚合酶.5.2 dNTP;dATP dTTP dCTP dGTP. 5.3DNA提取试剂：DNA提取试剂盒.5.7参考菌株：小肠结肠炎耶尔森氏菌Y.emterocolitica 8081（NCTC13174）.
5.4 10× Er Taq Buffer(20 mmol/L MgCl).5.5琼脂糖.5.6TAE缓冲液;2 mol/L Tris-HCI(pH8.4)，1 mol/L 乙酸，100mol/L EDTA.
6仪器和设备
6.1PCR扩增仪.6.2离心机. 6.3核酸蛋白分析仪.6.4电泳仪.6.5分子凝胶成像仪，6.6微量移液器和灭菌吸头：10pL、100μL、200μl、1000pl.6.7恒温培养箱. 6.8恒温水浴锅.6.9天平.6.10灭菌三角烧瓶：500ml、250ml6.11灭菌平m：90mm×15mm.6.12灭菌试管：内径3mm，长5cm
7检测程序
扩增结果阳性的样品进行克隆测序，将所得到的小肠结肠炎耶尔森氏菌7对管家基因测序结果上下游 对小肠结肠炎耶尔森氏菌7对管家基因分别设计引物，井进行PCR扩增（引物序列见表A.2），对序列整合后得到完整序列，将测序结果上传至MLST网站（ 基础上应用MEGA程序对菌株进行聚类分析（参见附录B）.
MIST的操作程序见图1.
图1MLST操作程序
8检测步骤
8.1提取细菌基因组DNA
将经过GB/T4789.8-2008的方法鉴定为小肠结肠炎耶尔森氏菌的菌株提取基因组DNA.
8.2MLST基因选择
选择耶尔森氏菌属的7个管家基因作为目的基因进行MLST分析，如表A.1所示，它们分别是蛋白UbiB合成酶基因（putative ubiquinone biosynthesis proteinUbiB，aarF）、双官能磷酸泛酰半胱氨酸 脱酶/磷酸泛酸合成酶基因（bifunctional phosphopantothenoylcysteine decarboxylase/phosphopanto-氨酰-tRNA合成酶基因（glutaminyl-tRNAsynthetase，glnS）、谷氨酰-tRNA还原酶基因（glutamyl-tRNAreductase，hemA）、双官能庚糖-7-磷酸激酶/庚糖-1-磷酸腺苷酰转移酶基因（bifunctionalheptose7-phosphate kinase/heptose 1-phosphate adenyltransferase，rfaE）、精氨酸脱般酶基因（arginine decar- boxylase speA)
8.3PCR引物和测序引物的选择
物在使用前按照相应分子量进行稀释到10μmol/L，一20C保存备用. 针对表A.1中小肠结肠炎耶尔森氏菌7个目的基因，合成7对相应的PCR引物序列（表A.2）.引
