中华人民共和国出入境检验检疫行业标准
SN/T 4525.4-2016
出口食品中致病菌的分子分型 MLST方法 第4部分：霍乱弧菌
Multilocus sequence typing detection method for pathogens in export foodPart 4:Vibriocholera
中华人民共和国 国家质量监督检验检疫总局 发布
前言
SN/T4525《出口食品中致病菌的分子分型M1.ST方法》共分10个部分：
第1部分：沙门氏菌；第3部分：副溶血性弧菌： 第2部分：金黄色葡萄球菌：第4部分：霍乱弧菌：第5部分：克罗诺杆菌；第6部分：化链球菌：第8部分：致泻性大肠埃希氏菌： 第7部分：空肠弯曲菌：第9部分：单核细胞增生李斯特氏菌：第10部分：小肠结肠炎耶尔森氏菌.
本部分为SN/T4525的第4部分.
本部分按照GB/T1.1-2009给出的规则起草.
请注意本文件的某些内容可能涉及专利.本文件的发布机构不承担识别这些专利的责任.
本部分由国家认证认可监督管理委员会提出并归口.
本部分起草单位：中华人民共和国江苏出人境检验检疫局、中华人民共和国北京出入境检验检疫局.
本部分主要起草人：付薄博、曾静、汪琦、张锡全、薛峰、蒋原、刘莉.
出口食品中致病菌的分子分型 MLST方法 第4部分：霍乱弧菌
1范围
SN/T4525的本部分规定了出口食品中霍乱弧菌分子分型MLST检测方法. 本部分适用于出口食品中霍乱弧菌的分子分型检测
2规范性引用文件
件.凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括的警改单）适用于本文件. 下列文件对于本文件的应用是必不可少的.凡是注日期的引用交件，仅注日期的版本适用于本文
GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法GB19489实验室生物安全通用要求GB/T27403实验室质量控制规范食品分子生物学检测SN/T1022-2010进出口食品中霍乱弧菌检验方法
3术语和定义、缩略语
3.1术语和定义
下列术语和定义适用于本文件3.1.1
管家基因house-keepinggenes
细胞中均要表达的一类基因，其 产物是对维持细胞基本 生命活动所必需的，其基因序列高度保守并且在大多数情况下持续表达. 又称看家基因，持家基因.
3.1.2
Taq DNA 商Thermus aquaticus DNA polyme从Thermusaquaticus细菌中提取的耐热DNA聚合酶. ase
3.2缩略语
dNTP：脱氧核糖核苷三磷酸（deoxy-ribonucleoside triphosphate） 下列缩略语适用于本文件.EDTA;乙二胺四乙酸（Ethylene Diamine Tetraacetic Acid)MLST：多位点序列分型（multilocus sequence typing）ST：序列型（Sequence Type) Tris：三（羟甲基）氨基甲烷[tris（hydroxymethyl）aminomethane]
4原理
MLST是通过测定多个管家基因中长度约为470bp核心片段的核苷酸序列，对其组合进行索引编
SN/T 4525.4-2016
号，不同的菌株对应不同的序列型，从而揭示菌株间等位基因的多样性.MI.ST分型中多个管家基因的序列分析比较在实验过程的操作性与结果的可靠性之间取得了平衡，且结果准确，所得数据在不同的实验室间具有良好的可比性.
5试剂和材料
除有特殊说明外，实验用试剂均为分析纯或生化试剂：实验用水符合GB/T6682中一级水的要求.试剂均用无DNA酶污染的容器分装.5.1DNA提取试剂：细菌基因组DNA提取试剂盒.5.2Taq DNA酶. 5.3dNTP:dATP、dTTP dCTP、dGTP.5.4引物：扩增引物和测序引物序列见表A.2.5.510×PCR缓冲液：200mmol/L Tris-HCl（pH 8.4).200mmol/L氯化钾.15mmol/L氯化镁.5.6琼脂糖凝胶.5.7Gelred核酸染色剂. 5.86×澳酚蓝上样缓冲液.5.9分子量标记：100 bp~2 000 bp DNA marker.5.105×TBE电泳缓冲液;445 mmol/L Tris 445mmol/1.硼酸，10 mmol/1LEDTA（pH8.0).使用时5.11质控菌株：霍乱弧菌Vb0非01霍乱弧菌或等效菌株. 稀释为0.5XTBE电泳缓冲液.
6仪器和设备
6.2天平：量程2kg.感量0.1g. 6.1离心机.6.3pH计.6.4涡旅振荡器.6.5 PCR仪.6.6电泳仪. 6.7凝胶成像仪.6.8基因测序仪.6.9超净工作台.6.10移液器：0.1 μl~2.5μl、2μL~20pL 20 μL~200μl.、100pL~1 000pl.
7检测程序
MI.ST的操作程序见图1.
图1MILST操作程序
8检测步骤
8.1细菌基因组DNA提取
将经过SN/T1022-2010的方法鉴定为霍乱弧菌的菌株提取基因组DNA.取待测样本1mL，加到1.5mL离心管中，8000r/min离心3min.弃去上清.加人750gLDNA提取液，65C温浴30min，加酚：三氯甲烷：异戊醇（25：24：1）500pL，振荡混匀，13000r/min离心5min，吸取500gL上清液5min，弃去上清，沉淀干燥后溶于30uLTE溶液中，立即用于检测或短期保存于-20C. 与400gL的异丙醇充分混合，13000r/min离心5min.75%乙醇冲洗沉淀一次，13000r/min离心
注：也可使用其他经验证的DNA提取方法或等效的商品化细菌DNA提取试剂盒，按照其使用说明操作.
8.2DNA浓度和纯度的测定
260nm和280nm处的吸光值A和As.DNA的浓度按式（1）计算： 取5μLDNA溶液加双蒸水稀释至1mL.使用核酸蛋白分析仪或紫外分光光度计分别检测
-（1）
式中：
DNA浓度，单位为微克每毫升（μg/mL）：260nm处的吸光值；
