中华人民共和国出入境检验检疫行业标准
SN/T4744-2017
Determination of sexhormone residues of live animal for import and exportHPLC-MS/MS
中华人民共和国 国家质量监督检验检疫总局 发布
前言
本标准按照GB/T1.1-2009给出的规则起草.本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口.本标准主要起草人：赵孔祥、娄婷婷、张俊哲、杨爽、王玉玲. 本标准起草单位：中华人民共和国天津出人境检验检疫局.
进出口食用动物性激素残留量的测定 液相色谱-质谱/质谱法
1范围
本标准规定了进出口食用动物维激素、孕激素和雌激素残留量的液相色谱-质谱/质谱检测方法.
本标准适用于出入境检验检疫工作中食用动物牛、羊、猪血清及尿中雄激素（群勃龙、勃地酮、维烯康力龙）.孕激素（块诺酮、21a-经孕酮、17a-羟孕酮、炔诺孕酮、甲羟孕酮、醋酸甲地孕酮、醋酸氯地孕酮、醋酸甲经孕酮、孕酮）和雌激素（雌三醇、雌二醇、雌酮、已烯雌酚、己
二酮、诺龙、美雄酮、睾酮、甲基睾酮二烯雎酚、已烷雌酚）的测定.
2方法提要
试样中的目标化合物经酶解过夜，甲醇溶液提取，石墨碳黑柱-氨基柱串联富集净化，液相色谱-串联质谱仪测定，内标法定量.
3规范性引用文件
下列文件对于本文件的应用是必不可少的.凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件.凡是不注日期的引用文件，其量新版本（包括的修改单）适用于本文件.
GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法
4试剂与材料
4.1除非另有说明，试剂均为分析纯，水为GB/T6682规定的一级水.
4.2甲醇：色谱纯
4.5乙酸：优级纯.
4.6二氯甲烷：色谱纯
4.73葡萄糖醛酸酶/硫酸酯酶溶液：≥100000U/ml.
4.8乙酸钠
4.9乙酸钠缓冲溶液（pH5.2）：溶解43.0g乙酸钠（NaAc4HO）于900mL水中，用乙酸调节pH到5.2，最后用水稀释至1L.
4.12二氧甲烷-甲醇溶液（9010.体积比）：取90mL二氯甲烷和10mL甲醇混合.
4.130.1%甲酸水溶液：量取甲酸1mL加水稀释至1000ml.
4.140.02%氨水水溶液：量取氨水200uL.加水稀释至1000ml.
4.15石墨碳黑固相萃取柱：500mg.6mL或相当者，使用前依次用5mL二氯甲烷-甲醇溶液（4.12），
SN/T
5mL甲醇.5mL甲醇-水溶液（4.11）活化.4.16NH：固相萃取柱：500mg.6mL或相当者，使用前用5mL二氯甲烷-甲醇溶液（4.12）活化.4.17标准物质：群勃龙、勃地酮、雄烯二酮、诺龙、美雄酮、睾酮、甲基睾酮、康力龙、炔诺酮、21a-羟孕酮、17o-羟孕酮、炔诺孕酮、甲羟孕酮、醋酸甲地孕酮、醋酸氯地孕酮、醋酸甲羟孕酮、孕酮、雌三醇、雌二醇、雌酮、已烯雌酚、已二烯雌酚、已烷雌酚纯度≥95%.化合物信息参见附录A中表A.1.4.18同位素内标：睾酮-d、甲基睾酮-d、雌二醇-d、雌酮-²d、已烯雌酚-d、已烷雌酚-d、17a羟孕 酮-d、醋酸甲地孕酮-d、孕酮-d.4.19标准储备液：准确称取适量的标准品及同位素内标，以甲醇稀释成1.0mg/mL的储备液，4C冰箱保存，有效期为3个月，4.20混合内标工作液：用甲醇将同位素标准储备液稀释成200.0μg/L的混合标准工作液.4.21混合标准工作液：根据需要用甲醇-水溶液（4.10）依次稀释成适当浓度的混合标准序列，内标浓度 为10 μg/L4.22微孔滤膜：有机系，0.22μm.
5仪器和设备
5.1液相色谱仪-申联质谱仪，配备电喷雾离子源.5.2电子天平，感量力0.0001g和0.01g.5.3氮吹仪.5.4涡旋混合器.5.6离心机，最高转速不小于10000r/min. 5.5恒温振荡器.5.7pH计.
5.8固相萃取装置.
6分析步骤
6.1试样制备
6.1.1血清
采集动物血样，待自然凝固后分离血清分装于小管，加盖密封.2℃~8C冷藏保存.
6.1.2尿样
采集动物尿样，于4℃.8000r/min离心10min后，上清分装于小管，加盖密封.2℃~8℃冷藏保存.
6.2试样处理
6.2.1样品的提取
称取试样1g（精确到0.01g）于50mL离心管中，加人50μL混合内标工作液（4.20），加10mL乙酸钠缓冲溶液（4.9），加人100μL3葡萄糖醛酸酶/硫酸酯酶溶液，37C±1C酶解过夜.加人15mL甲醇，超声提取30min，10000r/min离心5min，转移上清液转移至另一离心管中，加水至50mL，10000r/min离心5min，过滤，待净化.
6.2.2样品的净化
将样液转移到活化过的石墨碳黑固相萃取柱（4.15）上，控制流速2mL/min~3mL/min，依次用5mL甲醇-水溶液（4.11）、5mL甲醇-水溶液（4.10）和1mL甲醇清洗固相萃取柱，将小柱减压吹干，再将活化好的NH：固相萃取柱（4.16）串接在石墨碳黑固相萃取柱下方.用9mL二氯甲烷-甲醇溶液 （4.12）洗脱并收集洗脱液，弃去石墨碳黑固相萃取柱，用3mL二氯甲烷-甲醇溶液（4.12）洗脱NH：柱，洗脱液在微弱的氮气流下吹干，用1mL甲醇-水溶液（4.10）溶解残渣，涡旋混合均匀，过0.22μm微孔滤膜，供仪器测定.
6.3测定
6.3.1液相色谱条件
液相色谱条件如下：
a）色谱柱：C，100mm×2.1mm.1.7pm或相当者：b）柱温：35℃；c）雄激素、孕激素测定流动相：A为0.1%甲酸-水，B为甲醇；雌激素测定流动相：A为0.02%氨d）洗脱方式：梯度洗脱；雄激素、孕激素洗脱程序参见附录B中表B.1，雌激素洗脱程序参见 水-水，B为乙睛：流速0.2mL/min；表B.2e）进样量：20pl
6.3.2质谱条件
质谱条件如下：
a）离子源：电喷雾离子源：b）扫描极性：雄激素、孕激素为正离子、雌激素为负离子：c）监测方式：多反应监测（MRM）；d）分辨率：单位分辨.
其他参考质谱条件参见附录C.
6.3.3液相色谱-质谱检测及确证
6.3.3.1定性测定
每种被测组分选择1个母离子，2个以上子离子，在相同实验条件下，样品中待测物质的保留时间与标准溶液该物质的保留时间偏差在土5%之内，且样品中各组分定性离子的相对丰度与浓度接近的混 合标准溶液中对应的定性离子的相对丰度进行比较，偏差不超过表1规定的范围，则可判定为样品中存在对应的待测物.
表1阳性确证时相对离子丰度的最大允许偏差
相对离子丰度 >50% >20%~50% >10%~20% <10允许的相对偏差 %02干 ±25% ±30% ±50% 6.3.3.2定量测定 在仅器最佳状态下测定样液和标准工作溶液.样品中待测物残留量应在标准曲线范围之内，如果
