中华人民共和国出入境检验检疫行业标准
SN/T 4783-2017
出口食品中低聚三果糖、低聚四果糖、 低聚五果糖的测定高效液相色谱法
Determination of kestose，nistose and fructofuranosylnystose in export foodHighperformanceliquid chromatography method
前言
本标准按照GB/T1.1-2009给出的规则起草.
本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口.
心、中华人民共和国天津出人境检验检疫局、华南农业大学. 本标准起草单位：中华人民共和国广东出人境检验检疫局、国际检验检疫标准与技术法规研究中
本标准主要起草人：韦晓群、郑璇、宋志刚、娄婷婷、杜斯航、吴志航、张玉文、黄维龙、陈文锐、刘青、易蓉、王志元、梁瑞婷、卢珍珠.
出口食品中低聚三果糖、低聚四果糖、 低聚五果糖的测定高效液相色谱法
1范围
本标准规定了婴幼儿配方米粉米乳粉以及奶粉中低耶 、四糖、五糖等3种低聚果糖的测定方法.
本标准适用于婴幼儿配方米粉 米乳粉以及奶粉中低聚蔗果三糖、四糖、五糖的测定，
2规范性引用文件
件.凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括的修改单）适用于本文件. 下列文件对于本文件的应用是必不可少的.凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文
GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法
3方法提要
应用既定pH的乙酸水和甲醇溶流抗诞去除蛋白和淀粉后，样品中的低聚果糖再用β半乳糖酶处理去除半乳糖和乳糖，过膜上机测试，外标法定量
4试剂和材料
除另有说明外，所用试剂均为分析纯 水采用GB/T6682规定的二级水.
4.6低聚果糖标准品：蔗果三糖（CHO CASNo.：470-69-9），蔗果四糖（CHO，CASNo.：13133-07-8），蔗果五糖（CHO，CASNo.：59432-60-9)3种标准品，纯度≥99%.
4.7蔗果三糖、蔗果四糖、蔗果五糖混合标准储备液溶液：分别称取蔗果三糖、蔗果四糖、蔗果五糖的标 准品2.5g，一起用水溶解并定容于50mL.容量瓶，配成浓度分别为50000mg/mL的蔗果三糖、蔬果四糖、蔗果五糖混合标准溶液，2℃~4℃保存，有效期为3个月.
4.8蔗果三糖、蔗果四糖、蔗果五糖混合标准中间溶液：分别准确量取50000mg/mL的单标溶液（4.7）5.0mL，用水定容到25mL，配成浓度分别为10000mg/mL的蔗果三糖、蔗果四糖、蔗果五糖混合标准溶液，
4.9蔗果三糖、蔗果四糖、蔗果五糖标准混合工作溶液：分别移取10000mg/ml.蔗果三糖、四糖、五糖标准中间溶液（4.8）5mL、2.5mL、1mL、0.5mL、0.1ml.用纯水定容至10mL配成5000mg/ml、2500mg/ml、1000mg/mL、500mg/mL、100mg/mL的标准工作溶液，4C保存，可使用3个月.
SN/T 4783-2017
1mol/L的柠檬酸溶液10mL：称取0.71g磷酸氢二钠溶解与48mL纯水中，然后应用1mol/L的柠檬酸溶液调节磷酸氢二钠溶液pH至5.0.最后定容至50ml.
4.1120U/mLB-半乳糖苷酶溶液：称取103U/mg的β-半乳糖苷酶固体2mg.溶解在10.3ml.的缓冲溶液（4.10）中.2℃~4℃保存，可使用1个月
5仪器和设备
5.1高效液相色谱仅，配蒸发光散射检测器和柱恒温系统.5.2流动相真空抽滤脱气装置及0.2μm或0.45μm微孔膜. 5.3色谱柱：改性酰胺柱或者氨基柱，5μm，250mmX4.6mm（内径）或性能类似的分析柱.5.4分析天平：感量为0.01mg和0.001g各一台.5.5离心机：转速>10000r/min.5.6涡旋混合器.5.7旋转蒸发器.5.8恒温振荡水槽.
6测定步骤
6.1提取
6.1.1纯奶粉样品
间，溶解振荡5min，10000r/min离心5min，用定量滤纸过滤，加人0.2mL半乳糖苷酶，于45C下 称取0.25g样品于50mL离心管中，加人4.73mL水，加入0.07mL醋酸溶液调节pH至4~5之（是在恒温振荡水槽中）酶解3h，酶解后取1mL过0.22μm滤膜于进样瓶中，供上机分析.
6.1.2纯淀粉食品
间，然后加人20mL甲醇，振荡5min静置5min，用定量滤纸过滤，旋干滤液后，用水定容至4.8mL，加 称取0.25g样品于50mL离心管中，加人4.73mL水，加人0.07mL醋酸溶液调节pH至4~5之人0.2mL半乳糖苷酶，于45C下（是在恒温振荡水槽中）酶解3h.酶解后取1mL过0.22μm滤膜于进样瓶中，供上机分析.
6.1.3含奶粉和淀粉食品
称取0.25g样品于50mL离心管中，加人4.93mL水，加人0.07mL醋酸溶液调节pH至4~5之间，然后加入20mL甲醇，振荡5min后10000r/min.用定量滤纸过滤，滤液旋蒸至于，用水定容至4.8mlL.加人0.2mL半乳糖苷酶，于45C下（是在恒温振荡水槽中）酶解3h，酶解后取1ml过0.22μm滤膜于进样瓶中，供上机分析.
6.2测定
6.2.1液相色谱参考条件
由于测试结果取决于所用仪器，因此不可能给出色谱分析的普遍参数，采用下列参数已被证明对测试是合适的：
b）柱温：30℃.
c）流动相梯度见表1.
表1流动相梯度
时间/min 流动相A：水/% 流动相B：乙晴/%0 20 8018 41 5918.1 80 2023 80 2023.1 20 8030 20 80
d流速：1.0mL/min.e）进样量：10pl.
6.2.2检测仪器
蒸发光检测器.
6.2.3液相色谱测定
在仪器最佳工作条件下，以蔗果三糖、蔗果四糖、蔗果五糖混合标准工作溶液（4.9）浓度为横坐标，以峰面积为纵坐标，绘制标准曲线.用标准工作曲线对样品进行定量.使样品中3种低聚果糖的响应值在仪器测定的线性范围内.在上述色谱条件下，蔗果三糖的参考保留时间为11.7min，蓝果四糖参考保留时间为13.6min、蔗果五糖的参考保留时间为15.1min，3种低聚果糖标准溶液色谱图参见附录A中图A.1.
6.2.4标准曲线的绘制
按照6.2.1和6.2.2所列的测定条件，对提取液（6.1）依次进样测定.分别以标准工作溶液中每种低聚果糖浓度为横坐标，单位以“mg/kg”表示，以对应的峰面积为纵坐标，分别绘制标准工作曲线，得到线性方程.标准溶液色谱图参见附录A.
按式（1）计算回归参数：
(1 )
式中：
标准工作溶液中每种低聚果糖的峰面积；标准工作溶液中每种低聚果糖的浓度，单位为毫克每千克（mg/kg）； 回归曲线的斜率：回归曲线的截距.
7结果计算和表述
试样中低聚果糖（包括低聚三果糖、低聚四果糖、低聚五果糖等）含量由色谱数据处理软件或按式（2）计算获得，计算结果需扣除空白值，并保留3位有效数字：
按式（2）计算试样中待测物残留量（mg/kg）：
