中华人民共和国出入境检验检疫行业标准
出口食品中诺如病毒和甲肝病毒 检测方法实时RT-PCR方法
Qualitative detection of Norovirus and Hepatitis Avirusin foodfor export-Real-timeRT-PCR
中华人民共和国 国家质量监督检验检疫总局 发布
前言
本标准按照GB/T1.1一2009给出的规则起草.
本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口.
本标准起草单位：中华人民共和国山东出人境检验检疫局、中华人民共和国烟台出人境检验检疫局、中华人民共和国丹东出人境检验检疫局.
本标准主要起草人：赵玉然、尹伟力、薛晓宁、岳志芹、房保海、张瑾、麻丽丹、刘鑫、郑小龙、孙涛、王群.
出口食品中诺如病毒和甲肝病毒 检测方法实时RT-PCR方法
1范围
本标准规定了软果、硬果、瓶装水和贝类中诺如病毒GI、GⅡ型和甲肝病毒的实时荧光RT-PCR检测方法.
本标准适用于软果、硬果、瓶装水和贝类中诺如病毒GI、GⅡ型和甲肝病毒的定性检测.
2规范性引用文件
件.凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括的修改单）适用于本文件. 下列文件对于本文件的应用是必不可少的.凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文
GB19489实验室生物安全通用要求GB/T19495.2转基因产品检测实验室技术要求
3术语和定义及缩略语
3.1术语和定义
下列术语和定义适用于本文件.
3.1.1
诺如病毒Norovirus
诺如病毒为单股正链RNA病毒，属于人类杯状病毒属，是一种引起非细菌性急性胃肠炎的病毒.
诺如病毒感染性强，以肠道传播为主，通过口-粪传播，以污染的水源、食物、贝类、物品、空气作为主要传播载体.诺如病毒可分为GI~GV五个基因群，其中引起人类感染的主要是GI和GⅡ群.3.1.2
甲肝病毒HepatitisAvirus
甲肝病毒为单股正链RNA病毒，微小RNA病毒科中，嗜肝RNA病毒属，该属仅有HAV一个种.人类感染HAV后，大多表现为亚临床或隐性感染，出现呕吐、腹泻、黄痘症状，该病毒主要通过粪-口途径传播，以污染水源、食物、海产品（如毛等）、食具等作为传播载体.
3.1.3
Ct值cycle threshold value
荧光信号达到设定的阔值时所经历的循环数.
3.1.4
过程质控物质processcontrolmaterial
取与实时荧光RT-PCR过程，通过对最终过程质控物质回收率的计算，来评价整个检测过程的有效性. 通过添加与目的病毒类似、已知含量的外源质控物质，来监测整个检测过程，包括病毒收集、核酸提3.1.5
外源质控RNAexternalcontrolRNA
在实时荧光RT-PCR过程中通过添加与目的检测RNA相似或相同的、已知含量的外源对照
SN/T 4784-2017
RNA，用于检测RNA逆转录过程中有无抑制剂成分.
3.2缩略语
下列缩略语适用于本文件.NV：诺如病毒（Norovirus） HAV：甲肝病毒（Hepatitis Avirus）RT-PCR：逆转录聚合酶链式反应（reverse transcription-polymerase chain reaction）PC：过程质控（process control）EC RNA：外源质控RNA（externalcontrol RNA）
4试剂
实验用试剂均为分析纯：除特别说明外，实验用水为蒸馏水或去离子水.
4.1果胶酶，来源于黑曲霉（Aspergillusmiger）（20U/mg）.
4.9氯仿.
4.10正丁醇.
4.11磁珠法RNA提取试剂盒.
4.12下列物质均购自于ATCC：
a）Mengo病毒（MC.突变株，ATCCb）Hela细胞（ATCCCCL-2TM）：c）MS2噬菌体（ATCC15597B1）；d）宿主细菌E.coli（ATCC15597）.
4.13引物和探针：根据表1的序列进行引物和探针的合成，加人无RNase超纯水配制成10μmol/L浓度.引物扩增区域参见附录B.
表1实时荧光RT-PCR检测的引物和探针
病毒名称 扩增片段 大小 参考毒株基因 序列号及扩引物和探针序列（方向5'-3） bp 增基因位置Norovirus 正向引物 QNIF 4;CGC TGG ATG CGN TTC CAT M87661GI 探针NVGG1P FAM-TGG ACA GGA GAYCGCRATCT-BHQ 反向引物 NV1LCRCCT TAG ACGCCA TCA TCA TTT AC 86 5291-5376正向引物 QNIF2:ATG TTC AGR TGG ATG AGR TTC TCW GANorovirus GI 反向引物 COG2R；TCG ACG CCA TCT TCA TTC ACA 89 5012-5100 X86557探针QNIFSFAM-AGC ACR TGG GAG GGC GAT CG-BHQ
表1（续）
扩增片段 参考毒株基因病毒名称 引物和探针序列（方向5'-3'） 大小 序列号及扩正向引物HAV68：TCA CCGCCGTTT GCC TAG bp 增基因位置HAV 反向引物HAV240:GGA GAG CCCTGGAAGAAAG 173 M59809 68-240探针HAV150(-)，FAM-CCT GAA CCT GCA GGA ATTAA-MGBMengo 正向引物Mengo 110（FW);GCGGGT CCT GCCGAA AGT 反向引物Mengo 209(REV)，GAA GTA_ACA TAT AGA CAG ACG CACAC 100 L22089探针Mengo 147(PROBE)：FAM- ATC ACA TTA CTG GCC GAA GC-MGB 110-209正向引物MS2-TM2-F：GGCTGC TCG CGG ATA CCC JF 719743.1MS2 反向引物MS2-TM2-RTGAGGGAATGTGGGA ACC G 探针MS2-TM2JOE-ACC TCG GGT TTC CGT CTT GCT CGT-BHQ 202 3135-3336
5仪器与耗材
5.1实时荧光PCR仪.5.2冷冻离心机.5.3振荡摇床.5.4恒湿振荡水浴摇床.5.5pH计. 5.6超滤管.5.750mL离心管.
5.80.45μm的正离子滤膜.
6实验室环境与操作要求
实验室检测环境应符合GB19489的要求，操作技术规范应符合GB/T19495.2的要求.
7检测方法
7.1质控物质的选取
7.1.1PC物质
PC物质可以选择Mengo病毒或者MS2噬菌体，检测实验室根据自身条件选择其一，两种PC物质制备方法参见附录C.
7.1.2 ECRNA
ECRNA为已知核酸浓度且含有NVGI、NVGII、HAV目的检测片段的RNA.
