中华人民共和国出入境检验检疫行业标准
SN/T4825-2017
牛羊肝片吸虫病检疫技术规范
Quarantine protocol for Fasciolosis in bovine and sheep
中华人民共和国 国家质量监督检验检疫总局 发布
行业标准
牛羊肝片吸虫病检疫技术规范
前言
本标准按照GB/T1.1-2009给出的规则起草
本标准由国家认证认可督管理委员会提出并归口.
本标准主要起草单位：中国检验检疫科学研究院、中华人民共和国内蒙古出入境检验检疫局.
本标准主要起草人：吴绍强、王彩霞、赵治国、王海艳、吕继洲、林祥梅、赵林立、邓俊花、梅琳、崔强、敖威华、张晓东、陈宇飞.
牛羊肝片吸虫病检疫技术规范
1范围
本标准规定了牛羊肝片吸虫虫卵和成虫的形态学检查、肝片吸虫抗体ELISA检测及荧光PCR检测等技术规范.
本标准适用于牛羊等活动物肝片吸虫感染情况检测、牛羊肝脏等动物产品中肝片吸虫的检疫，也适用于牛羊养殖场肝片吸虫病的流行病学调查和监测.
2规范性引用文件
下列文件对于本文件的应用是必不可少的.凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件，凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括的修改单）适用于本文件.
GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法GB/T18088出人境动物检疫采样
3疫病概述
参见附录A，
4材料
4.1除另有规定外，所用化学试剂均为分析纯.试验用水要求达到GB/T6682中一级水的要求.
4.4酸乙醇：配制方法见B.3.
4.5德氏苏木素染液：配制方法见B.4.
4.7肝片吸虫抗体检测试剂盒：本标准以 IDEXX公司生产的Fasciola hepatica Antibody TestKit为 例进行操作，也可采用经过验证、检测效果确实的其他肝片吸虫ELISA检测试剂盒.
CACTGACAACTGAGTACC-3':FasITS-Q:5'-FAM-ACCCGATTATTAAACCACGATTCCGC-CACT-ECLIPSE-3'.引物和探针合成后均采用灭菌ddHO稀释为10pmol/L.扩增片段长度为89bp（具体序列参见附录C）.
4.9荧光PCR检测阴阳性对照：阳性对照为已知肝片吸虫样品：阴性对照为健康牛（羊）肝组织样品.
5仪器设备与耗材
5.1显微镜.
1）Fasciola hepatica Antibody Test Kit是适合的市售产品的实例，给出这一信息是为了方便本标准的使用者，并 不表示对这一产昌的认可.
SN/T 4825-2017
5.3 载玻片.5.7 一80C超低温冰箱、一20℃冰箱、4℃冰箱.5.9高压灭菌锅.5.10水浴锅， 5.11制冰机.5.12吸管、微量移液器及配套的吸
5.2动物解剖台.
5.4恒湿培养箱、振荡器.
5.5酶联免疫检测仪、超净台.
5.6实时荧光PCR仪
5.8高速冷冻离心机.
6检测方法
6.1病原形态学检查
6.1.1粪便检查
符合GB/T18088
采取粪便样品10g，置于烧杯内，注人100mL密度为1.18g/cm的饱和盐水，用玻璃棒搅拌至均匀的混悬液.静置15min~20min. 用小铲除去浮于表面的类渣.用吸管吸弃上清液，大量检查样品时，可将浮渣及上清液小心例出，在杯底利余20ml30ml沉渣.向道渣中加水至满杯，仔细用玻璃 棒搅拌至混悬液.使用网眼直径为0.25mm的金属筛过德混悬液，并使滤液静置5min.吸弃上清液，移于载玻片上，盖上盖玻片，在光学显微镜10倍物镜下循序镜检.
6.1.2剖检
按照常规的动物户体剖检操作步骤（见附录D）对死亡动物进行剖检 急性型可见幼虫移行时引起的肠壁、肝组织和其他器官的组织损伤和出血，腹整和“虫道“内可发现童虫.慢性型肝脏肿大，胆管呈绳索样凸出于肝表面，胆管壁发炎、租糙，有請酸盐沉淀，肝实质变硬.切开后在胆管内可见成虫，形似本耳状成虫钻出，伸展开后形似柳叶状呈红棕色.有时亦在胆囊中.将虫体按照附录E中的操作步骤采集后并制成虫体压片，置显微镜下观察虫体形态
6.1.3形态特征
6.1.3.1虫卵形态
虫卵椭圆形，淡黄褐色，133μm~190pm×7μm~91μm，卵的一端有小盖，卵内充满卵黄细胞和1个胚细胞（参见F.1）.
6.1.3.2成虫形态
虫体长为20mm~75mm.宽5mm~14mm.体表有细蒙，前编突出略似圆锥、叫头锥.口吸盘在虫肠，肠管分枝而且外侧枝较多，雌维同体，有精巢2个，前后排列是树枝状分支，卵巢一个呈鹿角状分支，卵.卵黄腺有许多褐色颗粒组成，分布于虫体两侧.体后端中夹有纵行的排泄管（参见F.2）.
体的最前端，在头锥之后腹面具腹吸盘.生殖孔在腹吸盘的前面.口吸盘的底部为口，口经咽通向食道和在前精巢的右上方，在辜丸前的虫体中央有卵模1个，在卵模与腹吸盘之间为曲折重叠的子宫，内充满虫
