中华人民共和国出入境检验检疫行业标准
SN/T4848.6-2017
出口蜂蜜中常见蜜源植物成分的检测方法 实时荧光PCR法 第6部分：龙眼
Identification of mon honey plant species in export honey-Real-time PCR methodPart 6:Longan
国家质量监督检验检疫总局 中华人民共和国 发布
前言
SN/T4848《出口蜂蜜中常见蜜源植物成分的检测方法实时荧光PCR法》共分为8部分：
第1部分：荆条；第2部分：油菜； 第3部分：详槐；第4部分：楼树：一第5部分：般树：一第6部分：龙眼：第7部分：荔枝和龙眼：
第8部分：紫云英.
本部分为SN/T4848的第6部分.
出口蜂蜜中常见蜜源植物成分的检测方法
实时荧光PCR法
第6部分：龙眼
1范围
SN/T4848的本部分规定了 出口蜂蜜中龙眼或分的实时荧光PCR检测方法.
本部分适用于出口蜂密中龙眼成分的定性检测，本部分所规定方法的最低检出限（LOD）为0.5%（质量百分比）.
2规范性引用文件
下列文件对于本文件的应用是 不可少的. 此是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件.凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括的修改单）适用于本文件.
GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法
GB14963-2011食品安全国家标准蜂蜜
GB/T27403-2008实验室质量控制规范 食品分子生物学检测
3术语和定义
下列术语和定义适用于本文件3.1
蜂蜜honey
蜜蜂采集植物的花蜜、分落物或密3.2
龙眼longan
龙眼（Dimocarpus longan Lour.) 又名瞬眼、桂圆、羊眼果树，无思子科、龙眼属植物.
实时荧光PCRreal timePCR
模板的定量及定性分析. 在PCR反应体系中加人荧光基团，利用荧光信号的积累实时监控整个PCR扩增过程，实现对起始
3.4
Ct值cycle threshold
每个反应管内的荧光信号到达设定的域值时所经历的循环数.
4缩略语
下列缩略语适用于本文件.DNA：脱氧核糖核酸（deoxyribonuleic acid）
PCR：聚合酶链式反应（polymerase chain reaction）dNTP：脱氧核苷酸三磷酸（deoxyribonuleoside triphosphate）dATP：脱氧腺苷三磷酸（deoxyadenosine triphosphate）dCTP：脱氧胞苷三磷酸（deoxycytidine triphosphate）dGTP：脱氧鸟苷三磷酸（deoxyguanosine triphosphate） dTTP：脱氧胸苷三确酸（deoxythymidine triphosphate）UNG：尿喀啶N-糖基化酶（uracilN-glycosylase）CTAB：十六烷基三甲基澳化铵（cetyltrithylammoniumbromide）Tris：三羟甲基氨基甲烷[Tris（Hydroxymethyl）aminomethane] EDTA：乙二胺四乙酸（Ethylene diaminetetraacetic acid）Taq：水生栖热菌（Thermus aquaticus）OD：光度密度（optical density）FAM：基荧光素（Carboxyfluorescein）TAMRA：胶基四甲基罗丹明（Carboxy-tetramethyl-rhodamine）BHQ1：黑洞猝灭基团1（Black hole quencher 1）
5方法提要
白对照，使用特异性引物和探针进行实时荧光PCR扩增，观察实时荧光PCR的增幅现象判定是否存在 提取样品DNA，以龙眼源性DNA为阳性对照，以其他密源植物DNA为阴性对照，无菌水作为空龙眼成分.
6试剂和材料
除另有规定外，试剂均为分析纯或生化试剂.实验用水符合GB/T6682的要求.试剂均用无DNA酶污染的容器分装.
6.1检测用引物和探针：龙眼成分扩增引物和探针、内参照（显花植物NADH基因）引物和探针详见表1.龙眼引物扩增的靶标序列参见附录A.
表1龙眼基因扩增引物探针序列
扩增片段物种名称 引物/探针序列（5→3'） 长度 把基园F;GCTGAAGCAGCTACTTTOGAAGTAACA内参照 R;AGGAGCCGTGTGAGATGAAAGTCTCA 138 bp NADH dehydrogenaseP FAM-TGGAGTGGGAGAGTCAGAGTCGAAAAGAGG-BHQ1 subunit B(ndhB ) geneF CCCAAGCTTCCTGATTGGGT superoxide dismutase龙眼 R AGGTGGTGTTTGTCGCTTCT 112 bp (FSD1b)geneP FAM-CTTCATTGAAAGAAAGGCATAACTAG-TAMRA
6.2三氧甲烷（氯仿）.6.3异丙醇.6.4体积分数为70%的乙醇6.5NaCI 溶液（1.2mol/L). 6.6蛋白酶K（20mg/mL).6.7 CTAB提取缓液;20 g/L CTAB 1.4mol/L NaC1.0.1mol/L Tris-HC1 0.02 mol/L NaEDTA pH 8.0.6.8CTAB沉淀液：5g/LCTAB，40mmol/LNaCl6.910×PCR 缓冲液:200 mmol/1 Tris-HCl(pH 8.4) 200 mmol/1. KC1.15 mmol/L MgCl6.10实时荧光PCR反应混合液：12.5pL反应体系包括：1U~2U（Unit，酶学单位）的Taq酶、1× PCR buffer、2.5 mmol/L~4.0 mmol/L的 Mg²0.2 U~1 U 的UNG 酶、0.2mmol/L 的 d(A.C G)TPs.0.2mmol/L~0.4mmol/LdUTP、400nmol/L.ROX染料（某些荧光PCR仪无需ROX校正）.
7仪器设备
7.1实时荧光PCR仪.7.2核酸蛋白分析仪或紫外分光光度计.7.3恒温水浴锅.7.4离心机：离心力≥12000g. 7.5微量移液器：0.5pL~10L，10pL~100pL，20 μL~200pL，200μL~1 000μl7.6恒温混匀仪.7.7涡旋震荡器.7.8pH计.7.9量简：容量50ml7.10烘箱.
8检测步骤
8.1DNA提取
8.1.1蜂蜜沉淀DNA提取
8.1.1.1蜂蜜样品50C水浴20min至充分融化，上下颠倒混匀.8.1.1.2取20mL蜂蜜样品，分成2管，每管10mL于50ml离心管中，加入无菌双蒸水至30mL，涡8.1.1.3沉淀部分用1mL无菌水洗脱，分装于2mL离心管中，12000r/min离心5min，去除上清. 旋混匀，4000r/min离心10min，吸出上清（4C存备用）.8.1.1.4加入600pLCTAB提取缓冲液，置于65℃恒温混匀仅中温育1h~2h，转速为650r/min；12000r/min离心10min 8.1.1.5转移上层清液至2mL离心管中：加人0.7倍体积的三氯甲烷，剧烈震荡混匀，室湿下 12 000r/min离心10min.8.1.1.6加人等体积CTAB沉淀液混匀，13000r/min离心10min8.1.1.7弃上清，加人350μL.1.2mol/LNaCl溶液，充分溶解沉淀.8.1.1.8加入0.8倍体积的异丙醇混匀，-20℃放置0.5h~1h.12000r/min转速4C离心10min~15 min
