中华人民共和国出入境检验检疫行业标准
SN/T4848.5-2017
出口蜂蜜中常见蜜源植物成分的检测方法 实时荧光PCR法 第5部分：树
Identification of mon honey plant species in export honeyReal-time PCRmethod-Part 5:Tilia
中华人民共和国 国家质量监督检验检疫总局 发布
前言
SN/T4848（出口蜂蜜中常见蜜源植物成分的检测方法实时荧光PCR法》共分为8部分：
第1部分：荆条；第2部分：油菜； 第3部分：洋槐；第4部分：楼树：第5部分：般树：第6部分：龙眼；第7部分：荔枝和龙眼：
第8部分：紫云英.
本部分为SN/T4848的第5部分.
本部分按照GB/T1.1-2009给出的规则起草.
请注意本文件的某些内容可能涉及专利.本文件的发布机构不承担识别这些专利的责任.
本部分由国家认证认可监督管理委员会提出并归口.
本部分起草单位：中国检验检疫科学研究院、中华人民共和国安徽出人境检验检疫局、中华人民共和国上海出入境检验检疫局.
本部分主要起草人：宗凯、李云飞、陈雪娇、吴亚君、孙娟娟、余晓峰、陈颖、周莉质、郑海松、杨艳歌、李想.
出口蜂蜜中常见蜜源植物成分的检测方法 实时荧光PCR法 第5部分：树
1范围
SN/T4848的本部分规定了出口蜂蜜中般树成分的实时荧光PCR检测方法，
本部分适用于出口蜂蜜中瞬树成分的定性检测.本部分所规定方法的最低检出限（LOD）为1%（质量百分比）.
2规范性引用文件
件.凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括的修改单）适用于本文件. 下列文件对于本文件的应用是必不可少的，凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文
GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法
GB/T27403-2008实验室质量控制规范食品分子生物学检测
3术语和定义
下列术语和定义适用于本文件.
3.1
蜂蜜honey
树tila
般树（TiliaranSzyszyl.）.别名：火绳树、家鹤儿、金桐力树树麻、叶上果、叶上果根，为般树科、树属的植物.
3.3
实时荧光PCRreal timePCR
在PCR反应体系中加人荧光基团，利用荧光信号的积累实时监控整个PCR扩增过程，实现对起始模板的定量及定性分析.
3.4
Ct值cycle threshold
每个反应管内的荧光信号到达设定的域值时所经历的循环数.
4缩略语
下列缩略语适用于本文件.
SN/T 4848.5-2017
DNA：脱氧核糖核酸（deoxyribonuleic acid）PCR：聚合酶链式反应（polymerase chainreaction）dNTP：脱氧核苷酸三确酸（deoxyribonuleoside triphosphate）dATP：脱氧腺苷三磷酸（deoxyadenosine triphosphate） dCTP：脱氧胞苷三磷酸（deoxycytidine triphosphate）dGTP：脱氧乌三磷酸（deoxyguanosine triphosphate）dTTP：脱氧胸苷三磷酸（deoxythymidine triphosphate）UNG：尿喀啶N-糖基化酶（uracil N-glycosylase）CTAB：十六烷基三甲基澳化铵（cetyltrithylammoniumbromide） Tris：三羟甲基氨基甲烷[Tris（Hydroxymethyl）aminomethane]EDTA：乙二胺四乙酸（Ethylene diaminetetraacetic acid)Taq：水生栖热菌（Thermusaquaticus）OD：光度密度（opticaldensity）FAM：胶基荧光素（Carboxyfluorescein） TAMRA：股基四甲基罗丹明（Carboxy-tetramethyl-rhodamine）BHQ1：黑洞猝灭基团1（Blackhole quencher 1）
5方法提要
提取样品DNA，以般树来源DNA为阳性对照，以其他蜜源植物DNA为阴性对照，无菌水作为空白对照，使用般树的特异性引物和探针进行实时荧光PCR扩增，观察实时荧光PCR的增幅现象判定是否存在根树成分.
6试剂和材料
除另有规定外，试剂均为分析纯或生化试剂.实验用水符合GB/T6682的要求.试剂均用无DNA酶污染的容器分装.
6.1检测用引物和探针：树成分扩增引物和探针、内参照（显花植物NADH基因）引物和探针详见 表1.极树引物扩增的靶标序列参见附录A.
表1极树基因扩增引物探针序列
物种名称 引物/探针序列（5'→3） 扩增片段 靶基园长度F:GCTGAAGCAGCTACTTTCGAAGTAACA NADH dehydrogenase内参照 R:AGGAGCCGTGTGAGATGAAAGTCTCA P:FAM-TGGAGTGGGAGAGTCAGAGTCGAAAAGAGG-BHQ1 138 bp subunit B(ndhB)geneF GGGCATCGAACATGAGCTTT根树 R TTCAACGAGTTTGCATGGGA 101 bp Nitrate reductase(mrl)P FAM-AAAGAAGATGCGCCTACAAGACCTGTTGC-TAMRA gene
6.2三氧甲烷（氯仿）.
6.3异丙醇.
SN/T 4848.5-2017
6.4体积分数为70%的乙醇.6.5NaCl 溶液（1.2 mol/L).6.6蛋白酶K（20mg/mL). 6.7CTAB 提取缓冲液：20 g/L CTAB.1.4 mol/L NaCl 0.1 mol/L Tris-HCl 0.02 mol/L NaEDTA pH=8.0.6.8CTAB沉淀液：5g/LCTAB.40mmol/LNaCl.6.910×PCR缓冲液：200 mmol/L Tris-HCl(pH=8.4) 200 mmol/L KCl.15 mmol/L MgCl.6.10实时荧光PCR反应混合液：12.5μL.反应体系包括：1U~2U（Unit，酶学单位）的Taq酶、1× PCR buffer、2.5 mmol/L~4.0 mmol/L 的 Mg 、0.2 U~1 U 的 UNG 酶、0.2 mmol/L 的 d(A.C.G)TPs、0.2mmol/L~0.4mmol/LdUTP、400nmol/LROX染料（某些荧光PCR仪无需ROX校正）.
7仪器设备
7.1实时荧光PCR仪.7.2核酸蛋白分析仪或紫外分光光度计.7.3恒温水浴锅.7.5微量移液器;0.5l~10μl.10L~100μl.20pL~200pL 200pl~1 000 μxL 7.6恒温混匀仪.7.7涡旋震荡器.7.8pH计.7.9量筒：容量50ml.7.10烘箱.
7.4离心机：离心力≥12000g.
8检测步骤
8.1DNA提取
8.1.1蜂蜜沉淀DNA提取
8.1.1.1蜂蜜样品50C水浴20min至充分融化，上下颜例混匀.8.1.1.2取20mL蜂蜜样品，分成2管，每管10mL于50mL离心管中，加人无菌双蒸水至30mL，涡旋混匀.4000r/min离心10min，吸出上清（4C贮存备用）. 8.1.1.3沉淀部分用1ml无菌水洗脱，分装于2mL离心管中，12000r/min离心5min，去除上清.8.1.1.4加人600μLCTAB提取缓冲液，置于65C恒湿混匀仪中温育1h~2h.转速为650r/min；12 000 r/min离心 10 min.8.1.1.5转移上层清液至2mL离心管中：加人0.7倍体积的三氯甲烷，剧烈震荡混匀，室温下12000r/8.1.1.6加入等体积CTAB沉淀液混匀.13000r/min离心10min. min 离心 10 min.8.1.1.7弃上清，加人350pL1.2mol/LNaCl溶液，充分溶解沉淀.15 min 8.1.1.9弃上清，用70%乙醇洗涤沉淀一次，12000r/min转速下4C离心10min. 8.1.1.10弃上清，室温下晾干.加人50μL~100μL双蒸水，溶解沉淀，一20C保存.
