前言
SN/T4849（出口食品及饮料中常见小浆果成分的检测方法实时荧光PCR法》系列标准共分为6部分：
第1部分：蓝莓： 第2部分：树莓：第3部分：黑加仑：第4部分：桑甚：第5部分：蔓越莓和蓝莓：第6部分：称猴桃.
本部分为SN/T4849的第4部分.
出口食品及饮料中常见小浆果成分的 检测方法实时荧光PCR法 第4部分：桑葚
1范围
SN/T4849的本部分规定了出口
品及饮料中桑甚成分的定性检测（清汁及果酒除外）.本部分所规定方法的最低检出限（LOD）为1% 本部分适用于鲜果、冷冻果、蜜饿 鲜榨果汁，果肉型果汁、果干、果酱等以桑葚为原辅料的初加工食（体积比）.
2规范性引用文件
下列文件对于本文件的应用是必不可少的.凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件.凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括的修改单）适用于本文件.
GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法
GB/T27403-2008实验室质量控制规范食品分子生物学检测
3术语和定义、缩略语
3.1术语和定义
下列术语和定义适用于本文件3.1.1
小浆果small berry fruits
浆果是指由一个子房或联合其他花器发育成的柔软多计的肉质单果，由一个或几个心皮形成.小浆果则泛指果实较小、多汁的一类浆果.3.1.2
桑喜mulberry
尊麻目桑科桑属植物果实，为聚花果，由多数卵圆形小核果集合而成，呈长圆形，黄棕色、棕红色至暗紫色，（部分品种成熟后呈乳白色）.拉丁文名：MorusalbaL.
3.2缩略语
下列缩略语适用于本文件.
PCR：聚合酶链式反应（polymerase chain reaction） DNA：脱氧核糖核酸（deoxyribonuleicacid）Ct值：每个反应管内的荧光信号到达设定的域值时所经历的循环数dNTP：脱氧核苷酸三磷酸（deoxyribonuleoside triphosphate）dATP：脱氧腺苷三磷酸（deoxyadenosine triphosphate）dCTP：脱氧胞苷三磷酸（deoxycytidine triphosphate）
SN/T 4849.4-2017
dGTP：脱氧乌苷三磷酸（deoxyguanosine triphosphate）dTTP：脱氧胸苷三磷酸（deoxythymidine triphosphate）UNG：尿喀啶N-糖基化酶（uracilN-glycosylase）Tris：三羟甲基氨基甲烷[Tris（Hydroxymethyl）aminomethane] CTAB：十六烷基三甲基澳化铵（cetyltrithylammoniumbromide）EDTA：乙二胺四乙酸（Ethylene diaminetetraacetic acid）Taq：水生栖热菌（Thermus aquaticus）OD：光度密度（optical density）
4方法提要
果实样品直接粉碎离心，果汁样品直接离心，提取沉淀DNA，果干、果酱、蜜饯先用蒸馏水清洗再提取DNA.以桑套果实为阳性对照，以其他水果DNA为阴性对照，无菌水作为空白对照.使用特异性引物探针进行实时荧光PCR扩增，通过实时荧光信号曲线判定是否存在桑甚成分.
5试剂和材料
除另有规定外，试剂均为分析纯或生化试剂.实验用水符合GB/T6682的要求.试剂均用无DNA酶污染的容器分装.
5.1检测用引物和探针：桑套成分扩增引物和探针、内参照（显花植物NADH基因）引物和探针详见表1.桑套引物扩增的靶标序列参见附录A.
表1桑葚序列引物探针
物种名称 引物/探针序列（5→3’） 扩增片 杷基因段长度内参照 R;AGGAGCCGTGTGAGATGAAAGTCTCA F:GCTGAAGCAGCTACTTTCGAAGTAACA 138 bp NADH dehydrogenaseP;FAM-TGGAGTGGGAGAGTCAGAGTCGAAAAGAGG-BHQ1 subunit B(mdhB)geneF;TGCGCCCTCAGCATAAAA桑甚 R;GAGCTCGTTTCGTTATGATTCCT 65 bp 28S ribosomal RNAP:FAM-CCAGGCGCGGAACGCGTC-BHQ1 (28S rRNA)gene
5.2三氯甲烷（氯仿）.5.3异丙醇.5.4CTAB 提取缓冲液：20 g/L CTAB，1.4 mol/L NaCl 0.1 mol/L Tris-HCl 0.02 mol/L NaEDTA，pH 8.0.5.670%乙醇（体积分数）. 5.5CTAB沉淀液：5g/LCTAB 40mmol/LNaCl.5.7蛋白酶K（20mg/mL).5.8实时荧光PCR反应混合液：12.5μL反应体系包括：1U~2U（Unit，酶学单位）的Taq酶、1×PCR buffer、2.5 mmol/L~4.0mmol/L的 Mg²、0.2 U~1 U 的 UNG 酶、0.2mmol/L的 d（A，C G)
TPs、0.2mmol/L~0.4mmol/LdUTP、400nmol/LROX染料.
5.910×PCR缓冲液：200mmol/LTris-HCl(pH8.4）.200mmol/LKCl 15mmol/LMgCl
6仪器设备
6.1实时荧光PCR仪. 6.2核酸蛋白分析仪或紫外分光光度计.6.3恒温水浴锅.6.4离心机：最大离心力不小于12000g.6.5微量移液器：0.5μL~10μL 10μL~100μL.20pL~200μxlL.200μL~1 000μl.6.6粉碎装置. 6.7涡旋震荡器.6.8pH计.6.9量筒：容量50ml.6.10烘箱.
7检测步骤
7.1样品前处理
鲜果、冷冻果样品直接粉碎，6000r/min离心，取沉淀物部分.果干、果酱、蜜饯类样品先用蒸馏水清洗3次，再粉碎.
果汁样品取适量15000r/min离心30min，取沉淀部分.
7.2DNA提取
取粉碎后的样品50mg~200mg，加人1mL裂解液，同时加人0.01倍体积的20mg/mL蛋白酶K，65C温育1h~2h，期间不时震荡混匀，应保证样品自由悬浮于液体中，必要时再加人适量CTAB提取缓冲液：取出后12000r/min离心10min，转移上清至2mL离心管中，加人0.7倍体积的三氯甲烷，剧烈震荡混匀，12000r/min转速下离心10min；转移上清至另一灭菌的离心管中，再加入0.7倍体积的 三氧甲烷，剧烈震荡混匀，室温下12000r/min离心10min；转移上清至干净离心管中，加人等体积的CTAB沉淀液混匀，室温沉淀1h；13000r/min的转速离心10min；弃上清，加人350pL1.2mol/LNaCI溶液，充分溶解沉淀；加人0.8倍体积的异丙醇或2倍体积一20C冰箱中预冷的无水乙醇混匀，-20℃放置30min，12000r/min4℃离心10min，弃上清，用70%乙醇洗涤沉淀一次，12000g4℃离心10min，弃上清，室温下晾干.加人50μL~100pL双蒸水，室温10min，混匀，-20C保存.
上述模板DNA均可用等效DNA提取试剂盒提取.
7.3DNA浓度和纯度的测定
使用核酸蛋白分析仅或紫外分光光度计分别检测260nm和280nm处的吸光值A和A.DNA的浓度按照式（1）计算：
式中：
c-DNA浓度，单位为微克每微升（μg/μL）；
A-260nm处的吸光值；
N--核酸稀释倍数.
