中华人民共和国出入境检验检疫行业标准
SN/T 4853.5-2017
转基因大米定量检测 数字PCR法 第5部分：LL62品系
Quantitative detection ofgeneticallymodifiedrice-DigitalPCR-Part5:EventLL62
中华人民共和国 国家质量监督检验检疫总局 发布
前言
SN/T4853《转基因大米定量检测数字PCR法）系列标准共分为7部分：
第1部分：TT51-1品系；第2部分：克螺稻品系； 第3部分：科丰6号品系；第4部分：M12品系；第5部分：LL62品系：第6部分：T2A-1品系：第7部分：T1C-19品系.
本部分为SN/T4853标准的第5部分.
本部分按照GB/T1.1-2009给出的规则起草.请注意本文件的某些内容可能涉及专利.本文件的发布机构不承担识别这些专利的责任.本部分起草单位：中国检验检疫科学研究院、中华人民共和国上海出人境检验检疫局. 本部分由国家认证认可监督管理委员会提出并归口.本部分主要起草人：李想、任怡菲、李晓虹、黄文胜、邓婷婷、陈颖、潘良文.
转基因大米定量检测数字PCR法 第5部分：LL62品系
1范围
本标准规定了稻谷和大米中LL62品系的数字PCR定量检测方法.本标准适用于稻谷和大米中LL62品系待异性的数字PCR定量检测
本方法的定量检测低限（LOQ）为0.1%（质量分数）.
2规范性引用文件
件.凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括的修改单）适用于本文件. 下列文件对于本文件的应用是必不可少的 凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文
GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法GB/T19495.1转基因产品检测 通用要求和定义GB/T19495.2转基因产品检测 实验室技术要求GB/T19495.3转基因产品检测 GB/T19495.5转基因产品检测核酸定量PCR检测方法 植酸提取线化方法GB/T19495.7转基因产品检测 抽样和制样方法SN/T1194植物及其产品转基因成分检测抽样和制样方法
3术语、定义和缩略语
3.1术语和定义
下列术语和定义适用于本文件
3.1.1
3.1.2
LL62转化体特异性序列event-specific sequence of LL62
外源DNA插人受体大米基因组后经重组产生的邻接区序列.具体序列参见附录A.3.1.3
Taq Taq DNA polymerase
源于水生栖热菌的耐热DNA聚合酶.
3.1.4
模板template
数字PCR引物/探针扩增检测的特定DNA片段.
3.1.5
定量检测低限limitofquantification：LOQ
在相对标准差不超过25%的条件下，检测方法所能定量的最低转基因成分百分含量.
SN/T 4853.5-2017
3.1.6
质控样品quality control sample
具有确定的SPS基因和转化体特异性序列拷贝数的基因组DNA.
3.1.7
微反应体系tinyreaction system
物理隔离的油包水液滴或其他微孔、微室中所形成的小体积荧光PCR反应体系. 将含有模板、引物/荧光探针、耐热DNA复制酶及其缓冲液充分混匀之后分配至体积相同且相互
3.1.8
转换系数conversionfactor
将转化体特异性序列和内参照基因拷贝数之比转换为转基因成分含量（质量分数）时所用系数.
荧光标记探针fluorescently taggedprobe
在5'末端和3末端分别连接荧光报告基团和萍灭基团的寡核甘酸.PCR扩增时，Taq酶的5'-3外切酶活性将探针水解，使报告基团和淬灭基团分离，从面释放出荧光信号.
3.2缩略语
下列缩略语适用于本文件.数字PCR：数字聚合酶链式反应（digitalpolymerase chainreaction）DNA：脱氧核糖核酸（deoxyribonuleicacid）dNTP：脱氧核苷酸三磷酸（deoxyribonucleoside triphosphate）NC：阴性对照（negaitive control） bp:碱基对（base pair）NTC：空白对照（no templatecontrol)PC：阳性对照（positive control）
4防污染措施
数字PCR定量检测过程的防污染措施应符合GB/T19495.2的规定.
5原理
数字PCR（digitalPCR）是在荧光PCR基础上发展起来的基因拷贝数定量检测技术，用于核酸模板的绝对拷贝数的测定.通过将含有模板、引物/荧光探针、耐热DNA复制酶及其缓冲液的荧光PCR反地分配至微反应体系中：微反应体系同时在相同的规定条件下进行PCR扩增反应之后，根据设定 应体系充分混匀之后等量均分为相互隔离的大数量（大于10000个）微反应体系，使每个模板独立随机的荧光阔值判断每个微反应体系的扩增结果：依据微反应体系的阳性率和泊松分布公式计算得到数字PCR反应体系中的模板浓度.
依据样品DNA溶液中的转化体特异性序列（event specifie sequence）和内参照基因（speciesspecificgene）的模板浓度之比，得到样品中相应的转基因品系含量.
6仪器和设备
6.1超纯水发生器（分子生物学级别）.
6.3生物安全柜.6.4PCR扩增仪.6.5数字PCR系统：微反应体系发生器或其他具有同样功能的仪器、微反应体系荧光检测仪或其他具有同样功能的仪器.6.6恒温孵育箱：控温精度士1.0℃.6.7样品粉碎机：可将大米或稻谷样品磨成60目左右的粉末.6.9涡旋振荡仪. 6.8核酸定量仪：Nanodrop3000或Modulus检测仪或其他核酸定量检测仪.6.10 离心机：最大离心加速度大于15000g，并适用0.2mL和1.5mL离心管.6.11移液枪：量程0.5pL~10μL;量程10gL~100pL;量程100pL~1000pL.
6.2分析天平：感量0.1g和0.1mg.
7试剂和材料
除另有规定外，试剂和材料质量应符合GB/T19495.1的要求.
7.1实验用水：应符合GB/T6682中一级水的规格.
数字PCR预混液：含有镁离子、dNTPs和具有5'-3'外切活性的热启动TaqDNA聚合酶的数字PCR专用预混试剂7.2引物和探针：SPS基因和LL62转化体特异性序列的数字PCR检测引物和探针信息详见表1.7.496孔荧光定量PCR反应板和封膜. 7.3数字PCR微反应体系生成联排管或芯片.7.50.2mL和1.5mL离心管.7.6移液枪头，量程0.5pL~10μL:量程10μL~100μL；量程100μL~1000μl.
表1SPS基因和LL62转化体特异性序列的引物和探针
扩增基因 名称 序列（5'-3'） PCR扩增片段长度SPS基因 上游引物 下游引物 GAGGTCACCAAGGCTGCCAGTG GCACTCCTGATTCTTCCAGGCTTC 122 bp探针 VIC-TAGGCTTCCCAGCAGGCAACCAA-BHQ1上游引物 AGCTGGCGTAATAGCGAAGAGGLL62转化体 下游引物 TGCTAACGGGTGCATCGTCTA 88bp特异性序列 探针 FAM-CCGCACCGATTATTTATA-MGB注1：表中PCR体系中引物/探针的终浓度可根据每合成批次的验证结果进行适当调整.注2：荧光探针的发光基团应与数字PCR仪的荧光通道匹配，通常用5'-FAM/3-BHQ1或5'-VIC/3'-BHQ1方式标记.注3：新合成的引物/探针干粉进行配制时，先将引物/探针贮存管短暂离心，然后开盖加纯水溶解，并稀释至 10μmol/L后分装，一20C避光保存.
