中华人民共和国出入境检验检疫行业标准
SN/T 1151.4-2003
对虾黄头病毒（YHV）逆转录 聚合酶链式反应（RT-PCR）检测方法
Protocol of reverse transcription polymerase chain reaction (RT-PCR)for yellowhead virus of shrimp (YHV)
中华人民共和国 国家质量监督检验检疫总局 发布
前言
本标事由围家认证认可警营理委员会据出并日口 本析准的财录A是风性附录，附录B是资料性附录.本标准起草单位，中华人民共和国深制出人境检验检疫局， 本标准主要起平人：刘症、史秀当、商险英、江育林.本标准系首农室布的检验检疫行业标座，
聚合酶链式反应（RT-PCR）检测方法 对虾黄头病毒（YHV）逆转录
1范围
本标准通用于对虾贯头病而的鉴定及其行病学调查、诊新、检疫和监剪. 本标准发定了用逆转录果会脂健式反应性水检别对好黄头病的方法.
2规范性引用文件
下列文件中的条款通过本标准的引用用成为本标准的条款.凡是往日期的引用文件-其随后所布是否可使用这些文件的最新板本.凡基不注日期的引用文件，其量新版本温用于本标准.
GB/T4682一192分析实酸室用水城格程试貌方（eq1SO3696:1187)
3试拆和材料
3.1水：应将合GB/T66B一1992中一级水的规格.3.2Tag附，一20℃保存.不要反复冻融或温度西变化 3.3逆转录酶AMV：一20℃保存.不要反复感融或照度别烈安化.3.4核糖额酸酶抑制剂（RNasin）：一20℃保存，不要反复冻融或蛋度变化， 3.5 dNTP(含 dCTP dGTP dATP dTTP 各 10 mmol/L) 3.6引1务像度为40μmol/L、其序列如下 上册利物 10F 5'-CCGCTAATTTCAAAAACTACG - 3′3.7身丙量：分析.使用前到冷到一20℃. 下静引I鲁 144R:5′-AAGGTGTTATGTCGAGGAAGT-3′3.8物图：K求元DNA和RNA.242 bp 190 hp 147 bp
4材和设备
4.1PCR增仪.4.2电移织， 4.3微量募液器及头.4.4累外属察灯. 4.5短湿培界箱.4.7电动匀舒、 4.6香通冰箱和低温冰箱4.9制冰机. 4.8高心机和高心管
5联排和制排
5.1取样
SN/T 1151 42003
5.1.1非新解的对虾息织作为样品，处理前要将群品放在冰上，如果2h以后才据处理，宜将样品保 存在无水乙雕中，元水乙赠体积是品体界片10以上、可放置在室温下保存4个月，应游巴特品需保在-7℃.
5.1.2对于仔虾成限师，取整只师减好头作种品，取虾头时，用天图药刀都疆子出除限哦、头购甲、所
5.1.3对于成账，取都拉，淋巴器官或虚淋匹作为品.
5.1.3.1歌邮就时，用灭要剪刀剪去头高侧的头购甲，出懋就，然后形身刀剪求丝.
5.1.3.2取游巴器官时，基除去头部以后的部，差切除头胸甲族方的嫌部，从头胸甲中间，将头换部分为两那分，是群出内部的国织器官，在置的想侧、开拥的后面，家出自色，显二观片状的游巴器言，后在针管猫进上一个26号的针头，新位对街，使膜部朝上，将针头水平地销人第一和第二对器足之
5.2制样
再加人150yLCTAB据糖（乳财录A中第A.2.章）.用小务刀务码-然后用均浆券将样品均某成状. 在15C下，在1.5mLPCR管中首先加人25mg~100mg组织或200La屏巴柠攀酸盘提合度，再加CTAB服糖期900μ 现勾置于25℃作用2h
6YHV酸的盛定
6.1核的班
09上基水根，然后加人1.5售体职物20C无东乙那.润句后，20C取置6h以上 15000r/mm高心 30min，资上得，2甲用建纸发干，37℃干燥20min.最后加10pL.水溶解后，作为PCR模板.
6.2变性和退火
在PCR管中规人10 1.模板指5μ2引物(上要引1物称下静引物备2.5xL) 置干70℃成皮5 min 立非冰指低速高心购5s复微体要中在层部.
6.3cDNA合成
新我（2oU)4.5yL.无菌高水1.5pL.再硬显50pL矿物我. 在上述反应管中继续加人dNTP2 μL5倍还转录酶缓呼核（完附录A中第A.6章)5L RNA排
心.42°℃60min反应制备模驱的cDNA，反皮结来后，70℃、10m灭括还转录酶，立肆冰签. 将 PCK管置于 PCR扩增仪 37C反定 10min后 再加人1L 逆转录酶AMV(20U)并氨进离
氯化硬（MgCl）（孔肥录A中第AL8章））0p1.10他Tq肠浓能强冲液（尼附录A中第A.9章）10L加求期息年积 100 xL
混匀斯低速离心，让矿物独在上层，再将及应管置于PCR扩增仅，先94℃、4mi，再开始35次错那c被能变性 94℃ 1 min引物逼火 58C1 min其种 72℃ 1 min)选尼 12℃下能特 10 mit 最后 4℃ 保痘.
6.5立对润
5.5.1在61中的样品处理过程中必领设立用性样品对理.阴性样晶对质空白对整.
6.5.2取告有己知YHV的病毒标塞栋的对舒组织总被作为阳性对用（阳性对航物血国家质量验管检 验酸疫总局指定单位现供）
6.5.3取正管的对好组织拍指权量作为前指对片.
6.5.4取等体积的水代答要板作为空白对照，
6.6晾整电泳
A.6章）平板，将平板胶人水平电珠槽，使电涨缓冲液洲好俺投股瓦，将6pL棒品缓冲液按比例提匀 用TBE（见附录A中第A.5章）电涂级冲液配制2%的球腺糖（含0.5pg/mLEB.见附录A中第后加人举品孔、在电腺时设空DNA标准分子量作对量，5V/em电据均0.5h.当该数蓝到达底部时 特止.
7能果判定
7.1在禁外灯下观账核股语并列断继录.7.2PCR系限性对照金出现一条135bp的DNA片数，用性对照和空自对照股有该核票管.7.4无带或带的大小不是135bp的为明性. 录B）进行比获，序列都似性在5为以上，可判新得男样品结果为阳性.
