中华人民共和国国家标准
GB/T14702-2018 代替GB/T14702-2002
Determination of vitamin B in premix-High performance liquid chromatograph
中国国家标准化管理委员会 国家市场监督管理总局 发布
前言
本标准按照GB/T1.1-2009给出的规则起草.本标准代替GB/T14702-2002《饲料中维生素B的测定高效液相色谱法》.本标准与GB/T14702-2002相比，主要技术内容修改如下：B的测定高效液相色谱法》：一增加了高效液相色诺-荧光检测器的色谱条件（见第7章，2002年版的7.2.2）；一增加了维生素B液相色谱-紫外检测器色谱条件下以及液相色谱-荧光检测器色谱条件下的本标准由全国何料工业标准化技术委员会（SAC/TC76）提出并归口. 标准色谱图（见附录A中图A.1和图A.2）.本标准起草单位：中国农业科学院农业质量标准与检测技术研究所[国家何料质量监督检验中心（北京）].本标准主要起草人：李兰、索德成、魏书林.本标准所代替标准的历次版本发布情况为： -GB/T 147021993、GB/T 14702-2002.
添加剂预混合饲料中维生素B的测定 高效液相色谱法
1范围
本标准规定了添加剂预混合饲料中维生素B（盐酸毗哆醇）测定的高效液相色谱法.紫外检测器色诺条件下的定量限为30mg/kg；荧光检测器色谱条件下的定量限为10mg/kg. 本标准适用于维生素预混合饲料和复合预混合饲料中维生素B的测定.
2规范性引用文件
件.凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括的修改单）适用于本文件. 下列文件对于本文件的应用是必不可少的.凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文
GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法GB/T14699.1饲料采样GB/T20195动物饲料试样的制备
3原理
试样中维生素B，经酸性提取液超声提取后，注人高效液相色谱仪反相色谱系统中进行分离，用紫外检测器（二极管矩阵检测器）或者荧光检测器检测，外标法计算维生素B的含量.
4试剂或溶液
除特殊说明外，所用试剂均为分析纯，水为蒸馏水，色谱用水为去离子水，符合GB/T6682中一级
4.1二水合乙二胺四乙酸二钠（EDTA）：优级纯. 用水规定.4.2庚烷磺酸钠（PICB）：优级纯.4.3冰乙酸：优级纯.4.4三乙胺：优级纯. 4.5甲醇：色谱纯.4.6盐酸溶液：取8.5m1.盐酸，用水定容至1000mL.4.8提取剂：在1000mL容量瓶中，称50mg（精确至0.001g）EDTA（4.1）、依次加入700mL去离子水，超声使EDTA完全溶解.加人25mL冰乙酸（4.3）、5mL三乙胺（4.4），用去离子水定容至刻度，摇 匀.取该溶液800mL与200mL甲醇混合，超声脱气，待用.4.9流动相：在1000mL容量瓶中，称50mg（精确至0.001g）EDTA（4.1).1.1g（精确至0.001g）庚烷磺酸钠（4.2），依次加人700mL去离子水，25mL冰乙酸（4.3）、5mL三乙胺（4.4），用去离子水定容至刻度，摇匀.用冰乙酸、三乙胺调节该溶液pH至3.70±0.10.过0.45pm滤膜.取该溶液800mL与
200mL甲醇（4.5）混合，超声脱气，备用.
GB/T 14702-2018
4.10维生素B标准溶液4.10.1维生素B 标准贮备液：准确称取维生素B（维生素B纯度大于98%）0.05g（精确至0.0001g）于100mL棕色容量瓶中，加盐酸溶液（4.6）约70mL，超声5min，待全部溶解后，用盐酸溶液（4.6）定容至刻度.此溶液中维生素B 浓度为500pg/mL，2℃~8C冰箱避光保存，可使用3个月.4.10.2维生素B标准工作液A：准确吸取2.00mL维生素B标准贮备液（4.10.1）于50mL棕色容量 瓶中，用磷酸二氢钠溶液（4.7）定容至刻度.该标准工作液中维生素B浓度为20μg/mL，2C~8C冰箱避光保存，可使用一周.4.10.3维生素B标准工作液B：准确吸取5.00mL维生素B标准工作液A（4.10.2）于50mL棕色容量瓶中，用磷酸二氢钠溶液（4.7）定容至刻度.该标准工作液中维生素B浓度为2.0μg/mL，上机测定前制备，可使用48h
5仅器设备
5.1高效液相色谱仪：配紫外检测器（二极管矩阵检测器）或荧光检测器.5.2pH计（带温控，精度为0.01）.5.4针头过滤器：备0.45μm水系滤膜. 5.3超声波提取器.
6试样制备
按GB/T14699.1的规定，抽取有代表性的饲料样品，用四分法缩减取样，按GB/T20195制备试样，磨碎，通过0.425mm孔筛，混匀，装人密闭容器中，避光低温保存备用.
7试验步骤
以下操作应避免强光照射.
7.1试样溶液的制备
称取维生素预混合词料试样0.25g~0.5g（精确至0.0001g）；复合预混合饲料试样2g~3g（精确至0.0001g），于100mL棕色容量瓶中，加人70mL磷酸二氢钠溶液（4.7）在超声波提取器（5.3）中超 声提取20min（中间旋摇一次以防样品附着于瓶底），待温度降至室温后用提取剂定容至刻度，过滤（若滤液浑浊则需5000r/min离心5min）.溶液过0.45μm滤膜（5.4），其中维生素B浓度约为2.0μg/mL~100μg/mL，待上机.
7.2测定
7.2.1高效液相色谱参考条件I
色谱柱：C，长250mm，内径4.6mm，粒度5μm，或性能相当的C柱.流动相：见4.9.流速：1.0ml/min.柱温：25C~28℃进样体积：10pL~20μl
检测器：紫外或二极管矩阵检测器，检测波长290nm.
7.2.2高效液相色谱参考条件Ⅱ
色谱柱：C，长250mm，内径4.6mm粒度5μm，或性能相当的C柱.流动相：A：磷酸二氢钠溶液（4.7），B：甲醇.梯度淋洗程序参见表1.
表1梯度淋洗程序
时间/min 磷酸二氢钠溶液（A1/% 甲(B/%0 00 0°66 1 0300 12.06 50 70 0 012 00 70 0 30 012 10 0°66 1 018 00 99 0 1 0
流速：1.0mL/min.柱温：25C~28C进样体积：10pL~20pL.
检测器：荧光检测器激发波长293nm；发射波长395nm.
7.2.3定量测定
根据所测样品维生素B的含量向色谱仪注人工作液A（4.10.2）或工作液B（4.10.3）及试样溶液（7.1），得到色谱峰面积的响应值，用外标法定量计算.维生素B荧光检测器色谱图参见附录A.
8试验数据处理
试样中维生素B（盐酸吡多醇）的含量，以质量分数w计，单位以毫克每千克（mg/kg）表示，按式（1）计算
*....( 1 )
式中：
A. 试样稀释体积，单位为毫升（mL）； 试样溶液峰面积值；v 标准溶液浓度，单位为微克每毫升（μg/mL）；V C' 试样溶液进样体积，单位为微升（μL）；V 标准溶液进样体积，单位为微升（L）；A标准溶液峰面积平均值.m试样质量，单位为克（g）； 测定结果用平行测定的算术平均值表示，结果保留三位有效数字.
9精密度
对于维生素B含量大于或者等于500mg/kg的饲料，在重复性条件下，获得的两次独立测定结果
