中华人民共和国国家标准
GB/T16125-2012代替GB/T16125-1995
Method for acute toxicity test of daphnia magna straus
(ISO 6341-1996 Water quality-Determination of the inhibitionof the mobility of Daphnia magna Straus(Cladocera Crustacea)Acute toxicity test NEQ)
中华人民共和国卫生部 中国国家标准化管理委员会 发布
前言
本标准按照GB/T1.1-2009给出的规则起草.
化如下： 本标准代替GB/T16125-1995《大型水蚤测试标准方法》，与GB/T16125-1995相比主要技术变
一将原标准名称（大型水蚤测试标准方法》修改为《大型涵急性毒性实验方法》：一将原标准的主题内容与适用范围修改为范围，并删除大型涵生长及繁殖实验方法（慢性效应）：依据GB/T1.1-2009调整了结构，增补了“规范性引用文件”、“术语和定义”： 一本标准4.2增加了标准稀释水的定义和配制方法：本标准6.1增加了样品采集与保存方法：本标准7.1增加了限度实验的内容和方法：-一本标准增加了质量控制和质量保证的内容和方法：将原标准附录A调整为附录A“大型涵的培养繁殖方法”和附录B"斜生栅藻的培养技术”
本标准使用重新起草参考1SO6341：1996（水质一大型涵（甲壳纲、枝角目）活动抑制的测定》编制，与ISO6341；1996的一致性程度为非等效.
本标准由中华人民共和国卫生部提出并归口，
本标准起草单位：中国疾病预防控制中心环境与健康相关产品安全所.
本标准主要起草人：刘凡、潘力军、高世荣、王俊起.
大型泽急性毒性实验方法
1范围
本标准规定了大型涵急性毒性实验方法.
本标准适用于评价可溶性化学物质的毒性、工业废水及固体废弃物浸出液的综合毒性、废水的处理效果、地表水、地下水及水中沉积物的毒性.
2规范性引用文件
下列文件对于本文件的应用是必不可少的.凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件.凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括的修改单）适用于本文件.
GB/T6682分析实验室用水规格和实验方法GB12997水质采样方案设计技术规定GB12998水质采样技术指导 GB12999水质采样样品的保存和管理技术规定
3术语和定义
下列术语和定义适用于本文件.
3. 1半数有效浓度median effective concentrationEC
3. 2
活动抑制immobilization
轻轻摇动实验容器，若15s之内大型潘不能游动，认为其运动能力受到抑制，即使其触角仍能活动，也应算做活动受抑制的个体.
4实验原理
本标准用大型涵为实验生物，将大型涵置于一系列浓度的实验溶液中，计数24h和48h大型涵活动能力受到抑制（包括死亡）的数量，计算24h和48h半数有效浓度（24hEC和48hEC），判断实验溶液的毒性程度.实验分为两个阶段：预实验和正式实验.
5试剂和材料
5.1一般要求
本标准所用试剂均为符合国家标准的分析纯化学试剂，实验用水要求参照GB/T6682.
5.2实验生物
取同龄同母体后代，培养1代~3代、出生6h~24h的幼蚤.实验用大型涵培养繁殖方法参见附录A. 大型涵（Daphnia magna Straus）（甲壳纲枝角亚目）62Dm纯品系生物株为实验涵种.实验用涵
5.3标准稀释水
5.3.1配制的标准稀释水pH为7.8士0.2;硬度为250mg/L±25mg/L（以CaCO计），Ca/Mg比例 接近4：1：溶解氧浓度在空气饱和值的80%以上：不应含有任何对大型涵有毒的物质.
5.3.2标准稀释水用电导率小于10μS/cm的纯净水按下述方法配制：硫酸镁溶液：将4.93g硫酸镁（MgSO7HO）溶于水中稀释至1L；碳酸氢钠溶液：将2.59g碳酸氢钠（NaHCO）溶于水中稀释至1L： 氯化钾溶液：将0.25g氯化钾（KC1）溶于水中稀释至1L：大型涵在其中生存至少48h.
各取以上四种溶液25mL混合，稀释至1L.调节pH，使其稳定在7.8土0.2.标准稀释水应容许
5.4稀释水
可采用未被有毒物质污染的天然水（地面水或地下水）及自来水（自然噪气的），其pH为7.0~8.5，溶解氧4mg/L以上，水的硬度为250mg/L±22mg/L（以CaCO，表示）.
6仪器和设备
6.1可采用小烧杯等玻璃制品，或者依据化合物的性质选择合适的实验容器，实验容器上加盖表面Ⅲ.为防止玻璃容器对实验物质的吸附，实验前可用低浓度实验溶液浸泡容器（空白对照组除外）1d.
6.2量筒、容量瓶、移液管、滴管、玻璃缸、尼龙筛网.
溶解氧测定仪、水质硬度计、pH计、温度计、电导仪、体视显微镜，
7样品
7.1样品的采集与保存
7.1.1按照GB12997、GB12998、GB12999的规定，采集废水样品时，应将采样瓶充满水样，不留空气.采集水质不稳定的工业废水，应在24h之内，每隔6h采样一次，分别测定每个样品，求得其最大毒性.
7.1.2样品采集后应立即进行实验.如果样品采集后6h之内不能进行实验，宜将水样冷藏保存 （0℃～4C）；超过6h，宜将水样冷冻保存（-18C），保存时间不超过2个月.
7.2样品的制备
7.2.1受试物可以是可溶于水的固体、液体或气体，但要求组分一定，具有代表性、重复性.
7.2.2易溶于水的实验物质可直接加到稀释水中，也可以溶解在蒸馏水中配成贮备液加人到稀释水中配成实验液.贮备液应低湿保存.难溶于水的物质，可使用超声波装置及其他低毒助溶剂增溶的方法，将其溶解和分散.如果使用助溶剂助溶剂在实验液中的浓度不应超过0.5mg/L.
7.2.3工业废水原水样为实验原液，作为100%，用稀释水按百分数（百分率）配制成各实验浓度.
7.2.4固体废弃物或水中沉积物，首先磨碎，按固液1：10比例加入蒸馏水，摇匀后浸泡24h，滤纸过滤，滤过液为被测工业固体废物或水中沉积物的浸出原液（100%），再用稀释水按百分数配制成各浓度.
8实验程序
8.1限度实验
以受试物在实验液中的最大溶解度作为限度实验浓度（若该物质的最大溶解度大于100mg/L.则以100mg/L作为实验浓度）实验结束时如果大型涵的活动抑制率低于10%，则不需进行下一步实验，否则应按照实验程序进行完整实验.
8.2预实验
8.2.1正式实验之前，为确定实验浓度范围，应进行预实验，除非有可参考的毒性数据.先将大型涵暴露于范围较广的浓度系列（如 o. 1mg/L、1 mg/L、10 mg/L或 1 mg/L、0. 1 mg/L、0. 01mg/L）中 24 h，每个浓度至少放5个幼蚤，通过预实验找出被测物使大型涵全部存活（或无活动抑制）的浓度以及全部死亡（或不动）的浓度，然后在此范围内设计出正式实验中各组的浓度.
8.2.2应了解毒物的稳定性，在稀释水中是否会出现沉淀、pH等理化性质的改变，以便确定正式实验是否需要采取流水或更换实验液及改变稀释水pH等措施.
8.3正式实验
8.3.1实验浓度设计.根据预实验的结果确定正式实验的浓度范围，按几何级数的浓度系列（等比级数间距）设计5个~7个浓度.实验浓度要设计合理（等比级系数不超过2.2，如1、2、4、8、16等比级系 数为2），最高浓度处理组大型涵全部死亡（或不动），最低浓度处理组大型涵全部存活（或无活动抑制），系列浓度中以能出现一个大型涵活动抑制率在40%～60%的浓度最为理想.
8.3.2每个实验浓度置大型涵5个，平均每个大型涵的实验液不少于2mL.每个实验浓度设3个平行.以不添加受试样品的实验组为空白对照组，内装与处理组相等体积的稀释水.如使用助溶剂，则应 设置溶剂空白对照组，实验前要用化学方法测定实验液的初始浓度.实验开始及结束时测定实验液的pH、水温和溶解氧（DO）.对不稳定性实验液采用定时更换的措施，实验期间大型涵不喂食.
8.3.3实验开始后应于24h及48h定时进行观察，记录每个容器中仍能活动的大型涵数，测定0%～100%大型涵活动抑制或死亡的浓度范围，并记录它们任何不正常的行为.
9质量控制和质量保证
9.1检查大型涵的敏感性及实验操作步骤的一致性，定期测定重铬酸钾的24hEC，20℃时重铬酸钾的24hEC应在0.5mg/L~2.0mg/L之间.9.2对照组（包括空白对照组和溶剂对照组）大型涵的受抑制率不能超过10%. 9.3应经检测证明受试物浓度保持于实验全过程（至少应为计划配制浓度的80%）.如果浓度偏差>20%，应以测试浓度结果为准.9.4实验开始和结束时，对照和处理组的实验用液pH变化范围不超过1.5；实验前的培养温度应与实验温度一致，实验可在18℃～22℃下进行，但同次实验温度的变化不超过士1℃，实验应在没有对 大型涵有害的气体、粉尘的大气条件下进行.实验结束时，对照组和实验组溶解氧浓度应大于或等于2mg/L.实验在自然光照（避免阳光直射）或光照周期（光暗比）为16：8，光照强度<10001x.9.5实验期间，应保持实验室条件正常，若出现停电、停水等情况而影响实验的，应及时停止实验待实 验室条件恢复正常后重新进行实验.
