GB/T 17999.6-2008
前言
GB/T17999《SPF鸡微生物学监测》分为10个部分： 第1部分：SPF鸡微生物学监测总则： 第2部分：SPF鸡红细胞凝集抑制试验： -第3部分：SPF鸡血清中和试验； -第4部分：SPF鸡血清平板凝集试验； 第5部分：SPF鸡琼脂扩散试验； 第6部分：SPF鸡酵联免疫吸附试验； 第7部分：SPF鸡胚敏感试验： -第8部分：SPF鸡鸡白痢沙门氏菌检验； 第9部分：SPF鸡试管凝集试验： 一第10部分：SPF鸡间接免疫荧光试验。
本部分为GB/T17999的第6部分。
本部分修订参照了GB/T18936-2003（高致病性禽流感诊断技术》、GB/T19167-2003（传染性囊 病诊断技术）、NY/T538-2002（鸡传染性鼻炎诊断技术》、OIE（陆生动物（哺乳动物、禽鸟和蜜蜂）诊断 试验和疫苗手册（第五版）中的有关规定。
本部分代替GB/T17999.5-1999（SPF鸡酶联免疫吸附试验》. 本部分与GB/T17999.5-1999相比主要变化如下： 增加了间接酶联免疫吸附试验； 增加了附录A“试剂的配制”。
本部分的附录A为规范性附录。
本部分由中华人民共和国农业部提出。
本部分由全国动物防疫标准化技术委员会（SAC/TC181）归口。
本部分起草单位：中国农业科学院哈尔滨兽医研究所、中国动物卫生与流行病学中心、济南斯帕法 斯家禽有限公司。
本部分主要起草人：曲连东、姜赛、韩凌霞、邵卫星、朱果、单忠芳、刘家森、司昌德、郭东春、于海波、 孟庆文。
本部分所代替标准的历次版本发布情况为： GB/T 17999. 51999。
GB/T 17999.6-2008
SPF鸡微生物学监测 第6部分：SPF鸡酶联免疫吸附试验
1范围 GB/T17999的本部分规定了酶联免疫吸附试验的技术要求。
本部分间接酵联免疫吸附试验适用于对SPF鸡进行以下病原微生物的血清抗体检测：副鸡嗜血杆 菌（Haemophilus）、鸡毒支原体（Mycoplasma gallisepticum）、滑液囊支原体（Mycoplasma synoviae）、 禽流感病毒（Avian Influeza Virus）、新城疫病毒（NewcastleDisease Virus）、传染性支气管炎病毒 (Infectious Bronchitis Virus）、传染性法氏囊病病毒（Infectious Bursal Disease Virus）、网状内皮增生症 病毒（Reticuloendotheliosis Virus）、鸡传染性贫血病毒（Chicken Infectious Anaemia Virus）、禽呼肠孤 病毒（病毒性关节炎）（Avian Reovirus）、禽脑脊髓炎病毒（AvianEncephalomyelitis Virus）、传染性气 管炎病毒（Infectious Laryngotracheitis Virus）、禽腺病毒Ⅲl群（EDS)（AvianAdenovirus Group Ⅲ）、淋 巴细胞白血病病毒（Lymphoid Leukosis Virus)。
本部分双抗体夹心酶联免疫吸附试验适用于对SPF鸡进行淋巴细胞白血病病毒P27抗原检测。
2原理 间接酶联免疫吸附试验采用已知微生物抗原检测未知抗体，双抗体夹心酶联免疫吸附试验采用已 知抗体检测未知抗原， 3间接酶联免疫吸附试验 3.1试剂 3.1.1包被抗原，阴性、阳性对照血清，羊抗鸡LgG酶标抗体，按说明书保存和使用。
3.1.2包被液、稀释液、底物液、终止液配制方法见附录A 3.2器材 酶标板，移液器，37C恒湿培养箱，酶标仪。
3.3操作程序 3.3.1抗原包被：将禽流感病毒、传染性支气管炎病毒、传染性法氏囊病病毒、传染性喉气管炎病毒、新 城疫病毒、副鸡嗜血杆菌、禽腺病毒Ⅲ群（EDS）、鸡毒支原体、滑液囊支原体、禽脑脊髓炎病毒、淋巴细胞 白血病病毒、网状内皮增生症病毒、禽呼肠孤病毒（病毒性关节炎）、鸡传染性贫血病毒抗原用包被液稀 释至工作浓度，加入酶标板各孔中，每孔100pL，置4C冰箱过夜。
3.3.2洗涤：甩净孔内抗原溶液，用洗涤液加满各孔，放置5min.然后甩净，如此重复3次。
孔两个，阳性对照孔、空白对照孔各一个，分别加入同样稀释的阴性血清、阳性血清和稀释液各100pL， 加不同的血清样品时应换吸头、37C温箱中作用30min。
3.3.4洗涤：同3.3.2. 3.3.5加羊抗鸡1gG酶标抗体：用稀释液将酶标抗体稀释至工作浓度，每孔加人100gL.37C温箱中 作用 30 min. 3.3.6洗涤：同3.3.2. 3.3.7显色：加人底物液100pl，室温避光反应5min左右（至阴性对照孔开始产生颜色时）。
GB/T 17999.6-2008 3.3.8终止及读数：每孔加50gL终止液终止显色，然后用酶标仪读取每孔在490nm处的吸光度 (OD)值. 3.4结果判定与表示方法 将样品的OD值代人式（1）计算。
S/N =阴性对照平均OD值被检血清样品OD值**(1 ) 式中： S被检血清样品OD值； N阴性对照平均OD值。
若S/N≥2则结果判为阳性，记为+”，否则判为阴性，记为”-” 4双抗体夹心酶联免疫吸附试验 4.1试剂 4.1.1包被抗体（兔抗P27IgG）、阳性抗原（P27）、阴性抗原、被检血清、被检蛋清、HRP-免抗P27、羊 抗鸡IgG酶标抗体按说明书保存和使用。
4.1.2包被液、稀释液、底物液、终止液配制方法见附录A。
4.2器材 见3.2。
4.3操作程序 4.3.1抗体包被：用包被液将兔抗P27IgG作适当稀释，每孔100pL，4C过夜。
4.3.2洗涤：甩去包被液，每孔加满洗涤液（约300gL)，静置3min，甩干，如此重复3次， 样品，洗涤同4.3.2。
4.3.4每孔加HRP-兔抗P27液（工作浓度）100μL37C作用45 min~60min，甩去HRP-兔抗P27 液，洗涤同4.3.2. 4.3.5加底物溶液：每孔加100xL新配制的底物溶液，避光作用15min. 4.3.6终止及读数：每孔加50gL终止液终止显色，然后用酶标仪读取每孔在490nm处的吸光度 (OD）值。
5结果判定 5.1当阳性对照OD值与阴性对照OD值之差大于或等于0.3时，试验结果可靠。
5.2按式（2）计算被检样品的S/P比值。
S/P=样品OD值均数-阴性对照D值均数 阳性对照OD值均数一阴性对照OD值均数 式中： S样品OD值； P一阳性对照OD值。
5.3判定：S/P≥0.2.判为阳性；S/P<0.2.判为阴性。
GB/T 17999.6-2008
附录A （规范性附录） 试剂的配制 A.1包被液 碳酸盐缓冲液（0.05mol/L、pH9.6，CBS）： 碳酸钠1.59 g 碳酸氢钠2.93 g 用双蒸水溶解至1000mL，于4C保存，不超过1个月。
A.2稀释液 磷酸盐缓冲液（0.01mol/L、pH7.4，PBS）： 氯化钠8g 磷酸二氢钠0.2 g 磷酸氢二钠（NaHPO12HO)2.9 g 氯化钾0.2 g 加蒸馏水至1 000 mL A.3洗涤液 含 0., 05 % Tween-20 的 0, 01 mol/L ,pH7, 4 的 PBS: Tween-2050 mL 加 0, 01 mol/L~pH7, 4 的 PBS 至1 000 mL A.4底物溶液 pH5.0，磷酸盐-柠檬酸缓冲液-OPD-HO： 磷酸氢二钠溶液（NaHPO12HO）1. 84 g 柠檬酸0,51 g 蒸馏水100 mL 106.4 Pa、30min灭菌，4C保存备用。
使用时每100mL中加入40mg邻苯二胺（OPD），溶解后加30%HO0.15mL.混匀后使用。
本 试剂现用现配。
A.5终止液 2mol/L硫酸： 硫酸（95%~98%)11. 1 mL 蒸馏水88, 9 mL...
