GB/T 180862000
前言 烟霜霉病是我国进境植物检疫危险性病害，为了防止该病菌随寄主传人我国，在进境检疫时，需正 确掌握烟霜霉病菌的检疫鉴定方法。
本标准在制定过程中，经过调查研究，分析有关资料和总结多年的实践经验，以及根据烟霜霉病菌 的生物学特性、病理学原理，确定各项技术指标。
本标准给出烟霜霉病病原菌的孢囊梗和孢囊及卵孢子的形态特征，两者可同时或单独作为烟霜霉 病菌的鉴定依据。
本标准的附录A是提示的附录，附录中的“冰冻匀浆法”是检验烟霜霉病菌卵孢子的一种较先进的 方法，但目前在国内尚未普及，故在检验烟霜霉病菌时，若条件允许，也可采用此法检验该病原产生的卵 孢子， 本标准由农业部提出。
本标准负责起草单位：中华人民共和国广东出人境检验检疫局。
本标准主要起草人：李怡珍、章正、钟国强、张传飞。
中华人民共和国国家标准
植物检疫 烟霜霉病菌检疫鉴定方法GB/T 180862000 Plant quarantineMethods for inspection and identification of Peronospora hyoscyami de Bary f. sp. tabacina (Adam) Skalichy
1范围 本标准规定了进境植物检疫中对烟霜霉病菌的检疫鉴定方法。
本标准适用于进境干烟叶和烟属植物种子、种苗的烟霜霉病菌检疫和鉴定。
2原理 烟霜霉病菌为专性寄生菌，烟叶被侵染为害后，出现边缘模糊、褪绿的近圆形斑点，后期形成淡褐色 可脱落的坏死病斑。
在适宜温湿度条件下，叶背面病斑长出淡蓝色霉状物，即烟霜霉病菌的孢囊梗和孢 囊：在一定条件下，病组织内可形成卵孢子。
病原菌的寄生专化性及其形态学特征是鉴定烟霜霉病菌的 依据， 3仪器、试剂 3.1手持扩大镜。
3.2带光源的扩大镜。
3.3双目解剖镜（10×～50×）。
3.4显微镜（100×~1000×）。
3.5 离心机(1 000 r/min~4 000 r/min)。
3.6不锈钢筛（孔径60um）。
3.7振荡器（200r/min）。
3.80.02mol/L磷酸缓冲液（pH=7）。
3.9苯胺蓝。
3.10乳酚油 乳酚油配制：苯酚结晶（水浴加热溶化）20ml、乳酸20mL、甘油40mL、蒸馏水20ml.混合而成。
3.1110%氢氧化钾溶液 氢氧化钾溶液配制：取氢氧化钾10g，加水90mL溶解配成10%氢氧化钾溶液。
4抽样 4.1抽查取样前查验待检烟叶的有关单证，核实产地、包装、唛头、品名、级别、收获年份及数量。
4.2用随机方法在货柜车、船舱、仓库堆位的上、中、下各层开件抽查，检查包内烟叶是否有可疑疫情。
随机在包内的各个部位取样，注意抽取等级差、叶色暗淡无光泽的烟叶带回室内检验， 4.3抽查件数 国家质量技术监督局2000-04-26批准2000-10-01实施
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GB/T 180862000 按货物批量总件数0.5%~10%开件抽查取样，500件以下的抽查20件，少于20件的全批抽查，其 余开件抽查件数如表1：
表1进境烟叶检疫抽查表 批量总件数，件抽查件数.件 500以下（含500件)20 000 1~[0s21~30 000 ~[00 [31~40 3 001~5 00041~50 5 001~10 00051~70 10 001 以上71~100 4.4取样质量 香料烟、打叶片烟每批取样6kg~15kg。
扎把烟每批取样20kg~40kg。
4.5烟属种子、种苗的抽样每批按总件数的5%～20%抽查，种子每批取样检验20g~50g，种苗每批 取样检验100株以上，少于100株的全检。
5烟叶检验方法 5.1病叶检查 在光线充足处，逐片检查烟叶有无烟霜霉病的可疑症状，叶背有无灰褐色的霜霉层。
5.2病原菌检验 5.2.1直接镜检 用解针挑取病斑上的霉状物制片镜检，用显微镜观察有无病原菌的孢囊梗和孢囊，记录其形态特 征，必要时测量孢囊梗的长度和孢囊的大小。
5.2.2洗涤检验 将未发现霜霉层的可疑病斑及碎片，置250ml三角瓶内，加人适量蒸馏水浸软后，用振荡器激烈 震荡5min，洗下病斑表面的病原物，将洗涤液倒进离心管，以1000r/min离心5min，倾去上层清液， 取沉淀液置载玻片上，盖上盖玻片，用显微镜检查有无烟霜霉病菌的孢囊梗和孢囊，每批样品至少检查 10个玻片。
5.2.3叶组织透明法检验卵孢子 选取病叶上霉状物稀少的老病斑置于小烧杯中，加适量10%氢氧化钾溶液（或其他叶组织透明试 剂），煮沸5min~10min至叶组织透明，加0.05%苯胺蓝（棉蓝）乳酚油作浮载剂，置显微镜下逐片观察 有无卵孢子。
5.2.4冰冻匀浆法检验卵孢子（见附录A） 5.3样品的保存 经检验完毕的大宗烟叶的样品，香料烟、打叶片烟等每批留样1kg~2kg，扎把烟每批留样2kg~ 4kg，注明烟样的合同号、产地、品名、级别、收获年份、抽样地点、时间等项目后分别存放于干燥、防虫处 保存2个月。
发现有烟霜霉病叶的样品，至少保存6个月，以备复检、谈判和仲裁。
保存期满后需作灭菌 处理。
6烟属植物的种子、种苗检验方法 6.1种子检验 随机选取种子10g~30g（含种子中夹杂的残株碎屑），用5.2.2条方法洗涤检验（该方法主要检验
GB/T 18086-2000 夹杂在种子中的残株碎屑是否带烟霜霉菌的孢囊梗和孢囊）。
6.2种苗检验 检查种苗叶片背面有无烟霜霉病症状，如有霜霉层，可用5.2.1条方法镜检病原的孢囊梗和孢囊。
对可疑烟苗，须作保湿检查：将可疑烟苗叶片展平，放入预制的直径15cm~20cm铺有3层湿滤纸的玻 Ⅲ中.加盖后形成小型湿室，置18C下无光照诱发培养12h～24h，然后在双目镜下仔细检查有无新生 的烟霜霉病的孢囊梗和孢囊。
7鉴定特征 烟霜霉病菌的孢囊梗无色，从寄主气孔中伸出，主轴较粗壮，上部呈双叉分枝3次～10次，孢囊梗 长400pm～750μm，宽7xm～11um；分枝角度越分越大，末枝呈镜角分叉，叉枝基部略粗并向末端变 尖，两叉枝长短略有差异，较长的一枝常弯曲，另一枝较直，末枝长7pm~14pm；孢囊在末枝顶编同步 形成，易脱落，无色或淡黄色，柠檬形或卵形，无乳头状突起，大小为（17μm~28pm）×（13μm~ 17μm）.孢囊壁薄、厚度均匀。
烟霜霉病菌的卵孢子壁与藏卵器壁分离。
成熟卵孢子星桔黄至红褐色，球形，直径为20μm~ 60um，外胞壁常有瘤状饰纹。
8结果判定 从烟叶上发现的霜霉病菌的孢囊梗和孢囊或卵孢子，符合上述形态特征的可鉴定为烟霜霉病菌。
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