中华人民共和国国家标准
GB/T 18246-2019代替GB/T18246-2000
饲料中氨基酸的测定
Determination ofamino acids in feeds
国家标准化管理委员会 国家市场监督管理总局 发布
前言
本标准按照GB/T1.1-2009给出的规则起草.本标准代替GB/T18246-2000《饲料中氨基酸的测定》.本标准与GB/T18246一2000相比，除了编辑性修改外，主要技术内容变化如下：一修改了标准的适用范围，增加了精料补充料，明确了不同处理方法所测定的氨基酸种类，增加 了各种氨基酸的摩尔质量和定量限（见第1章和附录A，2000年版的第1章）.3章、第4章、第5章、第6章）.一增加了氧化酸水解测定含硫氨基酸以外其他氨基酸的方法（见4.2）. 一修改了常规酸水解法盐酸水解溶液配方（见3.2.3.2000年版的4.1.1.1）.修改了盐酸提取溶液配方（见6.2.3，2000年版的4.3.1）.7.1.3) .修改了精密度的表述（见3.7、6.7.2000年版的第9章）. 修改了试验数据处理中的计算公式[见式（1）、式（3），2000年版的式（1）式（2）].一修改了附录A的内容，修改为各种氨基酸的摩尔质量和定量限（见附录A，2000年版的附录A).增加了氨基酸标准溶液色谱图（见附录B）.本标准由全国何料工业标准化技术委员会（SAC/TC76）提出并归口. 本标准起草单位：中国农业科学院农业质量标准与检测技术研究所[国家何料质量监督检验中心（北京）].本标准主要起草人：贾铮、赵根龙、李兰、樊霞、肖志明、李阳、刘晓露.本标准的历次版本发布情况为： GB/T 182462000
饲料中氨基酸的测定
1范围
本标准规定了饲料中总氨基酸（肤键结合和游离的）和游离氨基酸（天然和漆加的）测定方法，包括常规酸水解法、氧化酸水解法、碱水解法和酸提取法.
常规酸水解法适用于饲料原料、配合饲料、浓缩饲料、精料补充料和添加剂预混合饲料中含硫氨基酸（胱氨酸、半胱氨酸、蛋氨酸）和色氨酸以外的其他氨基酸（天门冬氨酸、苏氨酸、丝氨酸、谷氨酸、脯氨酸、甘氨酸、丙氨酸、颈氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、酪氨酸、苯丙氨酸、赖氨酸、组氨酸、精氨酸）含量的测定.
氢化酸水解法适用于饲料原料、配合饲料、浓缩饲料和精料补充料中含硫氨基酸（胱氨酸、半胱氨酸和蛋氨酸）的测定.以偏重亚硫酸钠为氧化终止剂时，可测定除酪氨酸、色氨酸以外的其他蛋白水解氨基酸：以氢溴酸为终止剂时，可测定除陷氨酸、苯丙氨酸、组氨酸和色氨酸以外的其他蛋白水解氨基酸.
碱水解法适用于饲料原料、配合饲料、浓缩饲料和精料补充料中色氨酸的测定.
酸提取法适用于配合饲料、浓缩饲料、精料补充料和添加剂预混合饲料中游离氨基酸的测定.
各氨基酸的定量限见附录A中表A.1.
2规范性引用文件
下列文件对于本文件的应用是必不可少的.凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件.凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括的修改单）适用于本文件.
GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法GB/T15399饲料中含硫氨基酸的测定离子交换色谱法GB/T20195动物饲料试样的制备 GB/T15400饲料中色氨酸的测定
JG1064氨基酸分析仪
3常规酸水解法
3.1原理
饲料中蛋白质在110C、6mol/L盐酸溶液作用下水解成氨基酸，经离子交换色谱分离和三酮柱后衍生化，脯氨酸于440nm波长处测定其他氨基酸于570nm波长处测定.
3.2试剂或材料
除特殊说明外，本标准所用试剂均为分析纯.
3.2.1水：应符合GB/T6682中一级水的规定.
GB/T 18246-2019
3.2.2盐酸：优级纯.3.2.3盐酸水解溶液（6mol/L）：将500mL盐酸（3.2.2）与500mL水混合，加1g苯酚，混匀.瓶中，加水溶解后加人盐酸（3.2.2)16.5mL，硫二甘醇5.0mL，苯酚1g，用水定容井过滤.3.2.5氨基酸标准储备溶液：含17种常规蛋白水解液分析用氨基酸（天门冬氨酸、苏氨酸、丝氨酸、谷氨酸、脯氨酸、甘氨酸、丙氨酸、胱氨酸、缴氨酸、蛋氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、酪氨酸、苯丙氨酸、赖氨酸、组氨酸和精氨酸），各组分浓度均为2.50μmol/mL，应使用有证标准溶液.3.2.6氨基酸标准工作溶液：准确移取2mL的氨基酸标准储备溶液（3.2.5）置于50mL容量瓶中，以柠橡酸钠缓冲溶液（3.2.4）定容，各氨基酸组分浓度为100nmol/mL，用安分装密封，每支约1mL，在2℃~8℃下保存，有效期3个月.3.2.7不同pH值和离子强度的柠檬酸钠缓冲溶液与带三酮溶液：按照仅器说明书配制或购买.3.2.8液氮.
3.3仪器设备
3.3.1氨基酸自动分析仪：具备阳离子交换柱、三酮柱后衍生装置及570nm和440nm光度检测器.3.3.2天平：感量0.1 mg和0.01 mg.3.3.3真空泵.3.3.4喷灯.3.3.5恒温干燥箱：温度可达110C土2C.3.3.6离心机：转速不低于4000r/min.3.3.7旋转蒸发器或浓缩器：可在室温至65℃间调温，控湿精度土1℃，真空度可低至3.3×10”Pa(25 mmHg).
3.4样品
按GB/T20195进行样品制备，粉碎过0.25mm孔径筛，混合均匀，装人密闭容器中保存，备用.
对于粗脂肪含量大于或等于5%的样品，需将脱脂后的样品风干、混匀，装人密闭容器中备用.对于粗脂肪小于5%的样品，可直接称样.
3.5试验步骤
3.5.1样品前处理
平行做两份试验.称取试样50mg~100mg（含蛋白质约7.5mg~25mg.精确至0.1mg）于20mL安或水解管中，准确加人10mL盐酸水解溶液（3.2.3），置液氮（3.2.8）中冷冻，使用真空泵抽真空至7Pa（≤5×10mmHg）后用喷灯封口或充氮气1min后旋紧管盖.将安或水解管放在110℃土2C恒温干燥箱中，水解22h~24h.冷却，混匀，开管，过滤，用移液管精确吸取适量的滤液，置于旋转蒸发器或浓缩器中，60℃下抽真空蒸发至干，必要时，加少许水，重复蒸干1次～2次.加人3mL～5mL柠檬酸钠缓冲溶液（3.2.4）复溶，使试样溶液中氨基酸浓度达到50nmol/mL~250nmol/mL摇匀，过滤或离心，上清液待上机测定.
3.5.2测定
将氨基酸标准工作溶液（3.2.6）注人氨基酸自动分析仪，以不同pH和离子强度的柠橡酸钠缓冲溶液与节三酮溶液（3.2.7）作为流动相和衍生剂，适当调整仅器操作程序及参数和洗脱用缓冲溶液试剂配比，应符合JJG1064氨基酸分析仪检定规程的要求，并保证苏氨酸-丝氨酸、甘氨酸-丙氨酸以及亮氨酸-异亮氨酸分离度分别不得小于85%、90%和80%，其标准落液色谱图参见附录B的图B.1、图B.2.注 人制备好的试样溶液和相应的氨基酸标准工作溶液进行测定，每5个样品（即10个单样）为一组，组间插人氨基酸标准工作溶液（3.2.6）进行校准.以保留时间定性，单点外标法定量.试样中氨基酸的峰面积应在标准工作溶液相应峰面积的30%~200%，否则应用柠橡酸钠缓冲溶液（3.2.4）稀释后重测.
3.6试验数据处理
试样中氨基酸含量以其质量分数u（%）计，未脱脂试样按式（1）计算，脱脂试样按式（2）计算：
式中：
-试样水解溶液稀释倍数：
A. 试样溶液中对应氨基酸的峰面积；试样水解溶液体积，单位为毫升（mL）；M---氨基酸的摩尔质量，单位为克每摩尔（g/mol)，各氨基酸摩尔质量见表A.1； -标准工作溶液中对应氨基酸的浓度，单位为纳摩尔每毫升（nmol/mL）；V.-氨基酸标准溶液进样体积，单位为微升（pL）；A氨基酸标准溶液中对应氨基酸的峰面积；m一试样质量，单位为毫克（mg）：V.试样溶液进样体积，单位为微升（uL）； F粗脂肪含量.%.以两个平行试样测定结果的算术平均值报告结果，保留两位小数.
3.7精密度
在重复性条件下，获得的两次独立测定结果与其算术平均值的绝对差值，当含量不大于0.5%时，不超过这两个测定值算术平均值的5%：含量大于0.5%时，不超过4%.
4氧化酸水解法
4.1含硫氨基酸的测定
按GB/T15399的规定执行.
4.2其他氨基酸的测定
4.2.1原理
以偏重亚硫酸钠为氧化终止剂时，可测定除陷氨酸、色氨酸以外的其他蛋白水解氨基酸；以氢溴酸
