中华人民共和国国家标准
GB/T 19495.3-2004
Detection of geneticallymodified organisms and derived products-Nucleic acid extraction
目 次
1范图.. 前言2规范性引用文件4实验室通用要求 ...5提取步骤 6测试报告附录A（规范性附录） 酚-三氯甲烷法提取DNA附录B（规范性附录） PVP法提取DNA II附录C（规范性附录） CTAB法提取DNA 13附录D（规范性附录） 附录E（规范性附录） 硅土法提取DNA 胍-三氯甲烷法提取DNA 16 18附录F（资料性附录） 提取DNA方法应用实例 20参考文献 22
前言
GB/T19495转基因产品检测》为系列标准：
GB/T19495.1-2004转基因产品检测通用要求和定义；GB/T19495.2-2004转基因产品检测实验室技术要求；GB/T19495.3-2004转基因产品检测核酸提取纯化方法；-GB/T19495.4-2004转基因产品检测核酸定性PCR检测方法；GB/T19495.62004转基因产品检测基因芯片检测方法： GB/T19495.5-2004转基因产品检测核酸定量PCR检测方法；-GB/T19495.7-2004转基因产品检测抽样和制样方法；GB/T19495.8-2004转基因产品检测蛋白质检测方法.
本部分引用了ENISO/DIS21571中的部分内容.
本部分的附录A、附录B、附录C、附录D和附录E为规范性附录，附录F资料性附录.
本部分由国家认证认可监督管理委员会提出并归口.
本部分由中华人民共和国质量监督检验检疫总局批准发布.
本部分起草单位：中华人民共和国山东出入境检验检疫局、中华人民共和国汕头出人境检验检疫局、中华人民共和国广州出人境检验检疫局、国家质量监督检验检疫总局动植物检疫实验所、中国农科院生物技术所、山东农科院植保所.
本部分主要起草人：高宏伟、相大鹏、覃文、朱水芳、陈长法、蔡额、许业莉、庄选林、梁希扬、甄宇江、金芜军、路兴波.
本部分系首次发布的国家标准.
转基因产品检测核酸提取纯化方法
1范围
GB/T19495的本部分规定了转基因产品中DNA提取纯化方法以及DNA落液浓度测定的基本要求.
本部分适用于转基因食品等加工产品，也适用于转基因农产品.
2规范性引用文件
下列文件中的条款通过GB/T19495的本部分的引用而成为本部分的条款.凡是注日期的引用文件，其随后的修改单（不包括勘误的内容）或修订版均不适用于本部分，然而，鼓励根据本部分达成 协议的各方研究是否可使用这些文件的最新版本.凡是不注日期的引用文件，其最新版本适用于本部分.
GB/T19495.1-2004转基因产品检测通用要求和定义GB/T19495.2-2004转基因产品检测实验室技术要求GB/T19495.5-2004转基因产品检测核酸定量PCR检测方法 GB/T19495.7-2004转基因产品检测抽样和制样方法
3原则
3.1一般性原则
核酸提取的目的是提供合适的用于后续分析的DNA.DNA的质量包括提取的DNA分子的平均长度，化学纯度以及DNA序列及双螺旋的完整性，例如，DNA碱基的链内、链间的联系，单链间隙的联系等.而且，这些情况是序列特异性的，因此在基因组中不是随机分布的.
3.2提取
同的DNA提取纯化方法适用于不同的样品. DNA提取的基本原则是释放样品中的DNA，随后纯化DNA去除PCR反应抑制剂.附录A中不
DNA定量有助于后续的PCR分析，可以通过物理方法（测量特定波长下的光吸收），化学-物理方法（结合可以发荧光的物质），酶法（生物荧光检测）或者定量PCR方法.后者最适用于多组分样品以及含量低或已降解的DNA.
4实验室通用要求
随机的DNA污染来源于灰尘及气溶胶.因此，实验室工作区域的组织以及良好的实验操作(GLP)基于：
-实验操作中每一步骤的系统控制；
样品操作的“单向流动”原则.后者可以保证被分析的DNA以及PCR产生的DNA保持分离性.具体要求应符合GB/T19495.2-2004中的规定.
5提取步骤
5.1测试样品的准备
5.1.1一般性要求
除了处于食物和（或）饲料链起始端的农产品和租加工材料（如粉碎的产品），大多数工业加工的食
品经过了物理、化学及酶的处理.这些处理会降低DNA的含量及纯度.因此，每一方法的适用性及重复性会随特异样品面异，一种特定的DNA提取方法的性质特征依赖于被研究的食品种类，实验室样品的代表性应符合GB/T19495.7-2004.
本部分附录A至附录E的方法中，测试样品量为250mg（200mg~300mg）对于DNA丰富的原材料（如种子）是足够的，但对于DNA含量低或有降解的材料面言是不够的.这种情况下，测试样品量可增加至1g~2g，超出这一上限的测试样品量不在本部分的框架范围内.
每个实验室样品应分别从两份测试样品中提取DNA.
标准品、实验室样品及测试样品的保存应按照GB/T19495.1-2004的规定执行.
5.1.2样品
实验室样品应充分均一再制备为测试样品.
测试样品的制备操作应按照GB/T19495.2-2004的规定执行，小心操作确保防止任何的污染和样品组分的改变.
前冷冻或冷冻干燥等方法处理. 液体含量高的固体或糊状样品不易被研磨成理想大小的颗粒，可以通过研磨过程中去除液体，研磨
对于膏状或粘性样品的研磨，可以采取下列的措施之一用来处理：
加热（不超过40C）；冷冻（≤-20C）. 置于液体中均质（如置于水中）；
上述方法处理后的实验室样品可能有稀释或浓缩，应混匀后制备两份测试样品.对于液体样品，摇是容器以便产品更均质化，对于诸如原油一类的无法均质化的样品，应确保的沉淀已经完全从容器的内壁脱离.
小.用来进行提取DNA的测试样品应包含GB/T19495.7-2004所规定的最少量的颗粒. 对于不易悬浮的固体样品，应该进行研磨以利于DNA提取.在这种情况下，应该注意到颗粒的大
任何可能产生灰尘的步骤应与其他分析步骤分离开来.根据附录中的方法，可清除的盐、调味品、粉状糖都应该被考虑到.
对于多组分样品，目标样品（比如鱼排中的面包层）可以被分离用来进行DNA提取.所使用的方法程序在分析报告中应进行描述.
5.2DNA提取与纯化
5.2.1一般性要求
淀粉、增稠剂）或者用有机试剂提取（如CTAB/三氯甲烷）： 一用合适的酶（果胶酶、纤维酶、半纤维酶、淀粉酶等）处理去除多糖类物质（果胶、纤维、半纤维、
-用合适的处理方法，比如RNA酶和蛋白酶分别处理RNA和（或）者蛋白质；
少量的液体残留可采用酶处理或者有机试剂处理（如正已烷）：
一可能对下游的分析产生干扰的盐（来自提取液、细胞分裂缓冲液和DNA沉淀等步骤）.
对于固体或者干燥的样品，细胞分裂缓冲液或抽提缓冲液的体积应足以保证DNA的溶解.
DNA的纯化可以通过酚、三氯甲烷、乙醇、异丙醇等少量溶剂来沉淀，或吸附在固体材料上（阴离子交换树脂，硅藻土或玻璃胶，膜等）.几种DNA纯化的方法可以结合进行.如果合理搭配的话，DNA的提取和纯化可以在同样的步骤中进行.
为了提高DNA的回收率，可在沉淀步骤中使用共沉淀剂（如糖原，PEG或t-RNA），这种共沉淀剂列DNA相类似的序列. 不应含任何核酸酶活性或者PCR抑制剂和（或）竞争剂，也不应包含任何可能在研究和检测中与目标序
真空冷冻干燥DNA时，应避免交叉污染.
