中华人民共和国国家标准
GB/T 19524.1-2004
肥料中粪大肠菌群的测定
Determination of fecalcoliforms in fertilizers
中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局 中国国家标准化管理委员会 发布
前言
本标准的附录A、附录B为规范性附录.本标准由中华人民共和国农业部种植业管理司提出. 本标准起草单位：农业部微生物肥料质量监督检验测试中心.本标准主要起草人：曹风明、沈德龙、李俊、姜昕、李力.
肥料中粪大肠菌群的测定
1范围
本标准规定了肥料中粪大肠菌群的测定方法.
2定义
下列定义适用于本标准.粪大肠菌群fecalcoliforms一群在44.5C士0.5C条件能发酵乳糖、产酸产气、需氧和兼性厌氧的革兰氏阴性无芽胞杆菌.粪大肠菌群数为每克（毫升）肥料样品中粪大肠菌群的最可能数（MPN）.
3仪器设备
高压蒸汽灭菌器；显微镜：恒温水浴或隔水式培养箱；恒温旋转式摇床：干燥箱：天平：酸度计或精密pH试纸；接种环；试管（15mm×150mm）；小套管（杜兰管）；移液管；三角瓶；培养Ⅲ；载玻片；玻璃珠； 酒精灯；试管架.
4培养基和试剂
4.1培养基：遵照附录A的规定.4.2革兰氏染色液：遵照附录B的规定.
5检验步骤
5.1样品稀释
在无菌操作下称取样品10.0g或吸取样品10mL.加人到带玻璃珠的90mL无菌水中，置于摇床上200r/min充分振荡30min，即成10稀释液.
用无菌移液管吸取5.0mL上述稀释液加人到45mL无菌水中，混匀成10-稀释液.这样依次稀释，分别得到10，10等浓度稀释液（每个稀释度须更换无菌移液管）.
5.2乳糖发酵试验
选取三个连续适宜稀释液，分别吸取不同稀释液1.0mL加入到乳糖胆盐发酵管内，每一稀释度接种3支发酵管，置44.5C土0.5C恒温水溶或隔水式培养箱内，培养24h士2h.如果乳糖胆盐发酵 管都不产酸不产气，则为粪大肠菌群阴性：如果有产酸产气或只产酸的发酵管，则按5.3进行.
5.3分离培养
从产酸产气或只产酸的发酵管中分别挑取发酵液在伊红美蓝琼脂平板上划线，置36C士1C条件下培养18 h~24 h.
5.4证实试验
从5.3分离平板上挑取可疑菌落，进行革兰氏染色，染色反应阳性者为粪大肠菌群阴性：如果为革兰氏阴性无芽胞杆菌则挑取同样菌落接种在乳糖发酵管中，置44.5C士0.5C条件下培养24h土2h.
5.5结果
证实试验为粪大肠菌群阳性的，根据粪大肠菌群阳性发酵管数，查MPN检索表，得出每克（毫升）肥料样品中的粪大肠菌群数.
帐
A.1乳糖胆盐发酵培养基
蛋白陈 猪胆盐 20.0 g 5.0 g乳糖 10 0 g0.004%溴甲酚紫水溶液 25. 0 mL蒸馏水 1 000 mLpH值 7.2~7.4
制法：将蛋白陈、猪胆盐及乳糖溶解于蒸馏水中，校正pH，加人澳甲酚紫水溶液，然后分装试管，每管9mL，并放人一支倒置的小套管，高压灭菌115C、15min.
注1：初发酵培养基.
注2：粪大肠菌群细菌发酵乳糖产酸产气使培养液由紫色变成黄色，套管内充有气体.
A.2伊红美蓝琼脂培养基
蛋白陈 10.0 g磷酸氢二钾（KHPO3H-O) 乳糖 2.0 g 10.0 g琼脂 20.0 g2%伊红Y水溶液 20. 0 mL0.65%美蓝水溶液 10. 0 mLpH值 蒸馏水 1 000 mL 7. 2~7.4
制法：将蛋白陈、乳糖、磷酸氢二钾溶解于蒸馏水中，校正pH，投人琼脂并加热溶解，分装于三角瓶中，高压灭菌115C、15min备用.伊红和美蓝溶液分别高压灭菌121C.20min.临用时加热熔化培养基，冷却至50C～55C，加人无菌的伊红和美蓝溶液，摇匀，倾注平板.
A.3乳糖发酵培养基
蛋白陈 20.0 g乳糖 10.0 g0.004%澳甲酚紫水溶液 蒸馏水 25. 0 mLpH 值 1 000 mL 7.2~-7.4
制法：将蛋白陈及乳糖溶于水中，校正pH，加人指示剂，按检验要求分装3mL~5mL，并放人1支倒置的小套管，高压灭菌115C、15min.
革兰氏染色液 （规范性附录）
B.1结晶紫染色液
甲液： 结晶紫 乙醇（95%） 2.0g 20 mL乙液： 草酸铵 0 8 g燕水 80 mL
将结晶紫研细后，加入95%乙醇使之溶解，配成甲液.将草酸铵溶于蒸馏水中配成乙液，甲液与乙液混合，静置48h后使用.
B.2卢哥氏（Lugol）碘液
（1） 1.0 g碘化钾（KI) 蒸馏水 2.0 g 300 mL
先将碘化钾溶解在少量蒸馏水（3mL~5mL）中，再将碘完全溶解在碘化钾溶液中，然后加人余下的蒸镐水.置于棕色瓶中可保存数月.
B.3脱色液
95%的乙醇，
B.4复染液
0.5%的番红水溶液：取2.5g番红花，溶于100mL无水乙醇中.取番红乙醇溶液20mL，加人80ml蒸馏水，即成0.5%番红水溶液.
