中华人民共和国国家标准
GB/T19542-2007代替GB/T195422004
饲料中磺胺类药物的测定 高效液相色谱法
Determination of sulfonamides infedsHigh-performanceliquid chromatography
中国国家标准化管理委员会 中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局 发布
前言
本标准是GB/T19542-2004《饲料中磺胺二甲基嘧啶和磺胺间甲氧嘧啶的测定高效液相色谱法》的修订版.
本标准与GB/T19542-2004主要差异如下：
补充了磺胺嘧啶、磺胺喹恶啉、磺胺甲恶唑三种磺胺药物的测定：
增加了净化步骤.
本标准自实施之日起代替GB/T19542-2004.
本标准由中华人民共和国农业部提出.
本标准由全国饲料工业标准化技术委员会归口.
本标准起草单位：国家饲料质量监督检验中心（北京）.
本标准主要起草人：李兰、杨曙明、索德成、田河山、范理、赵根龙.
GB/T 19542-2004
饲料中磺胺类药物的测定 高效液相色谱法
1范围
本标准规定了用高效液相色谱仪测定饲料中磺胺类药物：磺胺嘧啶、磺胺二甲基密啶、磺胺间甲氧嘧啶、磺胺甲恶唑、磺胺喹恶啉含量的方法.
本标准适用于配合饲料、浓缩饲料、添加剂预混合饲料中磺胺类药物的测定.
2规范性引用文件
下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款.凡是注日期的引用文件，其随后的修改单（不包括勘误的内容）或修订版均不适用于本标准，然面，鼓励根据本标准达成协议的各方研究 是否可使用这些文件的最新版本.凡是不注日期的引用文件，其最新版本适用于本标准.
GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法
GB/T14699.1饲料采样
3原理
试样中磺胺类药物经乙晴振荡提取后，用碱性氧化铝小柱净化，注人高效液相色谱仪反相色谱系统中进行分离，用紫外检测器或二极管矩阵检测器检测，外标法计算磺胺类药物的含量.
注：该方法最低定量限分别为：碱胺喀院、磺胺间甲氧嘧啶5mg/kg：碱胺二甲基嘧院、磺胺甲恶唑、磺胺喹恶啉 2 mg/kg .
4试剂和溶液
除非另有规定，在分析中仅使用确认为分析纯的试剂和符合GB/T6682规定的三级用水.
4.2乙睛：色谱纯. 4.1冰乙酸：优级纯.4.3乙晴：分析纯.4.4甲醇：色谱纯.4.5流动相：在1000mL容量瓶中加入750mL去离子水，移取冰乙酸（4.1）3mL加人水中，与 250mL乙睛（4.2）混合、摇匀，过0.45μm滤膜，脱气，备用.4.6磺胺嘧啶标准品：纯度应大于97%.4.7磺胺二甲基啶标准品：纯度应大于97%.4.8磺胺间甲氧磁啶标准品：纯度应大于97%.4.9磺胺甲恶唑标准品：纯度应大于97%. 4.10磺胺喹恶啉标准品：纯度应大于97%.4.11磺胺嗜啶标准溶液4.11.1磺胺嘧啶标准贮备液：准确称取已知纯度的磺胺磁啶标准品100mg，精确至0.0001g，置于100mL棕色容量瓶中，加乙腊（4.2）超声使之完全溶解，并定容至刻度，摇匀，该溶液中磺胺密啶浓度为4.11.2磺胺密啶标准中间液：准确移取磺胺嘧啶标准贮备液（4.11.1)5mL于50mL棕色容量瓶中， 1mg/mL，于一16C保存可使用6个月.用乙睛（4.2）定容至刻度，该溶液中磺胺嘧啶浓度为100μg/mL，于4C保存可使用1个月.
GB/T 19542-2007
4.11.3磺胺密啶标准工作液：准确移取磺胺嘧啶标准中间液（4.11.2)5mL于50mL棕色容量瓶中，用流动相（4.5）定容至刻度，该溶液中磺胺嘧啶浓度为10ug/mL，当日使用.
4.14磺胺甲恶唑标准溶液：配制过程同磺胺嘧啶.
4.15磺胺喹恶啉标准溶液
4.15.1磺胺唑恶哪标准贮备液：准确称取已知纯度的磺胺喹恶啉标准品100mg-精确至0.0001g，置于100mL棕色容量瓶中，加甲醇（4.4）超声使之完全溶解，并定容至刻度，摇匀，该溶液中磺胺喹恶 啉浓度为1mg/mL，于一16℃C保存可使用6个月.
4.15.2磺胺喹恶啉标准中间液：准确移取磺胺喹恶琳标准贮备液（4.15.1)5mL于50mL棕色容量瓶中，用乙晴（4.2）定容至刻度，该溶液中磺胺喹恶啉浓度为100pg/mL，于4C保存可使用1个月.
4.15.3磺胺喹恶啉标准工作液：准确移取磺胶唑恶啉标准中间液（4.15.2）5mL于50mL棕色容量瓶中，用流动相（4.5）定容至刻度，该溶液中磺胺喔恶啉浓度为10μg/mL，当日使用.
注：若单独测定各组分，也可配制标准工作液使测定组分的浓度在20ng~100ng之间.
4.16磺胺类药物混合标准工作液
分别移取磺胺类药物标准中间液各5mL于50mL棕色容量瓶中，用流动相（4.5）定容至刻度，该溶液中磺胺药物的浓度均为10pg/mL，当日使用.
注：若同时测定可配制混合标准工作液.
5仪器
5.1实验室常用仪器设备. 5.2具塞锥形瓶：150mL.5.3振荡器.5.4高效液相色谱仪：紫外检测器或二极管矩阵检测器.5.5针头过滤器：备孔径为0.45um有机微孔滤膜.5.6碱性氧化铝 SPE小柱：1 000mg/12mL、120A.
6试样的选取和制备
6.1按GB/T 14699.1采样.6.2选取有代表性饲料样品至少500g，四分法缩减至100g，磨碎，全部通过40目筛，混匀，装人密闭容器中，避光低温保存，备用.
7分析步骤
7.1试液的制备
7.1.1提取
加人50mL的乙晴（4.3），于振荡器（5.3）振荡提取30min，过滤，滤液备用. 称取配合饲料、浓缩饲料、添加剂预混合饲料样品2g（精确至0.001g），置于具塞锥形瓶（5.2）中，
7.1.2净化
准确吸取试液（7.1.1）：配合饲料10mL~20mL：浓缩饲料、添加剂预混合饲料2mL，移人用10mL乙晴淋洗过的碱性氧化铝小柱（5.5）中，令其自然流速流出.待试液（7.1.1）全部流出后，吹干， 用两次2mL流动相（4.5）洗脱，收集洗脱液，并过0.45pm的滤膜，滤液上机测定.
7.2色谱条件
7.2.1色谱柱：具有C填料的柱子（粒度为5μm），柱长250mm，内径4.6mm
7.2.2流动相：25%乙睛水（4.5）.以1.0mL/min流速洗脱.
7.2.3进样量：20L.
7.2.4检测器：紫外检测器或二极管矩阵检测器，检测波长270nm.若单独测定磺胺密啶检测波长为 268nm：磺胺二甲基嘧啶检测波长为266nm：磺胺间甲氧嘧啶检测波长为271nm:磺胺甲恶唑检测波长为268nm：磺胺喹恶啉检测波长为246nm.
8定量测定
标准工作液（4.16）及试样溶液（7.1），得到色谱峰面积响应值，用外标法定量. 按高效液相色谱仪说明书调整仪器操作参数.向液相色谱柱中注人待测定磺胺标准工作液或混合
9结果计算
9.1试样中每种磺胺的含量分别按式（1）计算：
**.*. ( 1 )
式中：
-试样中每种磺胺的含量，单位为毫克每千克（mg/kg）：P试样溶液峰面积值； V-样品的总稀释体积，单位为毫升（mL）；c-标准溶液浓度，单位为微克每毫升（gg/mL）；V标准溶液进样体积，单位为微升（uL）：P标准溶液峰面积平均值； m试样质量，单位为克（g）；V试样溶液进样体积，单位为微升（gL）.
9.2平行测定结果用算术平均值表示，保留三位有效数字，
10重复性
同一分析者对同一试样同时两次平行测定结果的相对偏差不大于10%.
