中华人民共和国国家标准
GB/T21102-2007
Identification of rabbit derived materials in animal-originated feedstuffsReal time PCRmethod
中国国家标准化管理委员会 中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局 发布
前言
本标准由中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局提出.
本标准由全国饲料工业标准化技术委员会归口.
本标准主要起草单位：中华人民共和国辽宁出人境检验检疫局、宝生物工程（大连）有限公司、中国检验检疫科学研究院、中华人民共和国山东出入境检验检疫局、中华人民共和国深圳出人境检验检疫局、中华人民共和国上海出人境检验检疫局.
宗卉、金东权. 本标准主要起草人：郑秋月、李品泉、王玉萍、徐昊、曹际娟、于爱画、张舒亚、陈颖、徐宝梁、高宏伟、
本标准首次发布.
动物源性饲料中免源性成分定性 检测方法实时荧光PCR方法
1范围
本标准规定了动物源性饲料中免源性成分实时荧光PCR检测方法，该检测方法的检出限为0. 1%.
本标准适用于动物源性饲料中免源性成分的定性检测.
2规范性引用文件
下列文件中的条款通过本标准的引用面成为本标准的条款.凡是注日期的引用文件，其随后的修改单（不包括勘误的内容）或修订版均不适用于本标准，然面，鼓励根据本标准达成协议的各方研究 是否可使用这些文件的最新版本.凡是不注日期的引用文件，其最新版本适用于本标准.
GB6682分析实验室用水规格和试验方法GB/T 14699.1饲料采样(GB/T14699.1-2005，ISO6497:2002.IDT)
SN/T1193基因检验实验室技术要求
3术语和定义
下列术语和定义适用于本标准.
实时荧光PCRreal timePCR
实时荧光聚合酶链式反应.
3.2
Ct值cyele time
每个反应管内的荧光信号达到设定的闽值时所经历的循环数.
4原理
采用TaqMan实时荧光PCR技术，根据线粒体DNA的细胞色素C氧化酶亚单位I（cytochrome C胞，三氯甲烷抽提蛋白质，异丙醇沉淀得到DNA：以提取的DNA为模板进行实时荧光PCR扩增.本 oxidasesubunitI，COX1）基因上动物种间多态性的差异而进行兔源性成分鉴定.利用裂解液破碎细标准应用多色荧光检测技术，采用多重PCR方法，将所用试剂配制成预混合形式，组建成实时荧光PCR兔DNA检测试剂盒.对反应液中含有的两种不同荧光染料进行双通道同步检测，在同一反应管内对免的COX1基因及内参照基因同时进行扩增，并通过标记两种不同荧光物质6-骏基荧光素（6-car-boxyfluorescein，FAM）、5-六氯荧光素（5-hexachloro-fluorescein，HEX）的探针进行特异性杂交，两色荧 光同步检测.其中，对内参照反应的检测，可以监控反应是否正常进行，防止假阴性结果.观察实时荧光PCR的增幅曲线，从而对饲料中免源性成分进行快速检测.
5试剂与材料
除另有规定外，试剂为分析纯或生化试剂，实验用水符合GB6682的要求.
5.1DNA提取用试剂
5.1.1三氯甲烷.
GB/T 21102-2007
5.1.5裂解液：1%CTAB（cetyltrithylammonium bromide，十六烷基三甲基溴化铵），0.05mol/LTris-HC1(pH 8 0）[Tris ：tris（hydroxymethyl）aminomethane三（羟甲基）氨基甲烷]，0.7mol/LNaCl 0 01 mol/L EDTA (pH8. 0)(ethylene diaminetetraactic acid 乙二胺四乙酸)
5. 1.6TE 缓冲液(Tris-HCI、EDTA 缓冲液): 10 mmol/L Tris-HCI(pH8. 0) 1 mmol/L EDTA(pH8 0).
5.2实时荧光PCR免DNA检测试剂盒
5.2.12×兔源性检测预混合液：含有ExTaq HS（终浓度1.25U/25pL）、dNTPs（终浓度各0.4mmol/L)Mg²（终浓度3 mmol/L)
5.2.2免源性检测引物混合液：含有扩增免基因组DNA及内参照的引物（序列详见表1）、内参照(A DNA).各引物终浓度0. 1 pmol/L~1. 0rmol/L
表1免及内参照引物序列
名称 序列兔5-引物 兔3-引物 5′-TAATCGTCACCGCACATGCC-3′5′-CTATGTCAGGAGCCCCAATTATCA-3′内参照5'-引物 5′-GGCTGATTGACCGGCAGATTA-3′- 5′-GCGGGTATAGGTTTTATTGATGGC-3
5.2.3免源性检测探针混合液：检测免基因组DNA的探针及检测内参照的探针（序列详见表2）.探针浓度与使用的实时荧光PCR扩增仪、荧光标记物质种类有关，实际使用时请参照仪器说明书，或各荧光探针的具体使用要求进行.
表2免及内参照探针序列
名称 序列兔探针 5′(FAM)-ACAAGCCAGTTCCCGAAGCCTCCA -3′(Eclipse)内参照探针 5′(HEX)-CCGCCACGACGATGAACAGACGCT 3’(Eelipse)
5.2.4阳性对照：用已知含哺乳动物源性成分的样品作阳性对照.
5.2.5双蒸水，
6仪器设备
6.1实时荧光PCR检测系统.6.3电子天平：感量0.01g. 6.2核酸蛋白分析仪或紫外分光光度计.6.4离心机：离心力12000g.0~00~0-00~96.6实时荧光PCR反应管.6.7恒温水浴箱.
7试样选取与制备
按照GB/T14699.1采样，将实验室样品粉碎，充分混合均匀后待用.
8检验步骤
8.1样品的总DNA提取
心管中，加人600 L~800 μL裂解液，65C 30min，每隔10min 振荡混匀：12000r/min离心5 min，吸取上清液至一新离心管中.加400yL三氯甲烷异戊醇（241)，充分混匀：12000r/min离心5min，吸取上清液至一新离心管中，加0.8倍体积异丙醇，室温下沉淀1h~2h:12000r/min离心10min，弃上清液；70%乙醇洗涤一次，晾干：加人50LTE，溶解沉淀.
也可用等效的DNA提取试剂盒提取模板DNA.
8.2DNA浓度和纯度的测定
取5gLDNA溶液加双蒸水稀释至1mL，使用核酸蛋白分析仪或紫外分光光度计测260nm和280nm处的吸光值A和As.DNA的浓度按式（1)计算：
式中：
--DNA浓度，单位为微克每微升（μg/pL)；A260nm处的吸光值；
N核酸稀释倍数.
当A/A比值在1.7~1.9之间时，适宜于PCR扩增.
8.3实时荧光PCR检测
8.3.2在各实时荧光PCR反应管中加入上述试剂后，盖紧管，离心5s~10s. 性检测探针混合液各加 1 plL，样品 DNA（1 ng/μL~100ng/μL)1L 加双蒸水至25pl.8.3.3将离心后的实时荧光PCR反应管放入实时荧光PCR检测系统内，记录样本摆放顺序.8.3.4实时荧光PCR反应参数可根据基因扩增仪型号的不同进行适当的调整，一般的反应程序为：95T10s，1个循环；95C5s 60C30s.40个循环，在每次循环的退火时收集荧光.8.3.5检测结束后，根据扩增曲线和Ct值判定结果.8.3.6检测过程中分别设阳性对照、阴性对照和空白对照.用已知含免源性成分的样品作阳性对照， 用已知不含兔源性成分的样品作阴性对照，用等体积的双蒸水代替模板DNA作空白对照.
注：也可用等效的兔源性成分实时荧光PCR检测试剂盒进行实时荧光PCR检测.
9结果判断与表述
9.1结果分析条件设定
直接读取检测结果.阀值设定原则根据仪器噪声情况进行调整.
9.2结果判定
9.2.1对照结果
空白对照：无FAM荧光信号检出.有HEX荧光信号检出，C1值应<35.0.阴性对照：无FAM荧光信号检出.有HEX荧光信号检出，C1值应<35.0.阳性对照：有FAM和HEX荧光信号检出.且FAM通道出现典型的扩增曲线，Ct值35为无效值（详见表3）.
