中华人民共和国国家标准
GB/T21106-2007
Identification of Cervus derivedmaterials in animal-originatedfeedstuffs-PCRmethod
中国国家标准化管理委员会 中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局 发布
前言
本标准的附录A为资料性附录.
本标准由中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局提出.
本标准由全国饲料工业标准化技术委员会归口，
本标准起草单位：中国检验检疫科学研究院、中华人民共和国深圳出人境检验检疫局、中华人民共和国辽宁出人境检验检疫局、中华人民共和国山东出入境检验检疫局.
赵贵明. 本标准主要起草人：陈颖、吴亚君、徐宝梁、王品、钱增墩、宗卉、曹际娟、高宏伟、黄文胜、袁飞、
本标准首次发布.
动物源性饲料中鹿源性成分定性 检测方法PCR方法
1范围
本标准规定了动物源性饲料中鹿（Cervus）源性成分检测的PCR方法，该检测方法的检出限为0.1%（质量分数）.
本标准适用于动物源性饲料中鹿源性成分的定性检测.
2规范性引用文件
下列文件中的条款通过本标准的引用面成为本标准的条款.凡是注日期的引用文件，其随后的修改单（不包括勘误的内容）或修订版均不适用于本标准，然面，鼓励根据本标准达成协议的各方研究是否可使用这些文件的最新版本.凡是不注日期的引用文件，其最新版本适用于本标准.
GB6682分析实验室用水规格和试验方法GB/T 14699.1何料采样(GB/T 14699.1-2005.1SO 6497:2002IDT)
SN/T1193基因检验实验室技术要求
3术语和定义
下列术语和定义适用于本标准.
3. 1
聚合酶链式反应polymerase chain reaction：PCR
用于扩增位于两段已知序列之间DNA（deoxyribonucleosidea acid，脱氧核糖核酸）的方法.模板别与模板DNA两条链上的一段互补序列发生退火，接着在DNA聚合酶的催化下以4种dNTP（de- DNA经过高温变性成单链，在DNA聚合酶和适宜的温度下，两条互不互补的寡核苷酸片段即引物分oxyribonucleoside triphosphate，脱氧核苷酸三磷酸）为底物，使退火引物得以延伸，如此反复变性、退火循环，扩增倍数达到约10°.
4原理
利用裂解液破碎细胞，三氯甲烷抽提蛋白质，无水乙醇沉淀得到DNA：以提取的DNA为模板进行PCR扩增，琼脂糖凝胶电泳检测PCR扩增产物：PCR阳性产物应用限制性内切酶酶切反应进行确证.
5试剂和材料
除另有规定外，试剂为分析纯或生化试剂.实验用水符合GB6682的要求.
5.1鹿源性成分检测用引物（对）序列为：F;5'-TCATCGCAGCACTCGCTATAGTACACT-3'R:5'-ATCTCCAAGCAGGTCTGGTGCGAATAA-3'5.2TaqDNA聚合酶（Taq.Thermus aquatica，水生栖热菌）. 5.3限制性内切酶：Al1酵.5. 4dNTPs dATP( deoxyadenosine triphosphate 脱氧腺苷三磷酸) dTTP( deoxythymidine triphos-
phate，脱氧胸苷三磷酸）、dCTP（deoxycytidine triphosphate，脱氧胞苷三磷酸）、dGTP(deoxyguanosinetriphosphate，脱氧鸟昔三磷酸）.5.6澳化乙锭. 5.5琼脂糖：电泳纯.5.7三氯甲烷.5.8无水乙醇，5.970%乙醇.5.11裂解液：1%CTAB（cetyltrithylammonium bromide，十六烷基三甲基溴化铵）.0.05 mol/LTris 5.10DNA分子量标准品（100 bp~600 bp)（bp:base pair，碱基对）.HCl(pH8 0）Tris ：tris（hydroxymethyl)ansinomethane，三（羟甲基）氨基甲烷]，0. 7 mol/L NaC1 0. 01 mol/L EDTA (pH8 0)(ethylene diaminetetraacetic acid 乙 二胺四乙酸).5.12TE 缓冲液（Tris-HCI EDTA 缓冲液）；10 mmol/L Tris-HC1 （pH8. 0)，1 mmol/L EDTA5. 13 10 ×PCR 缓冲液:100 mmol/1L KC1 160 mmol/L (NH);SO 20 mmol/L MgSO 200 mmol/L (pH8.0).Tris-HC1（pH8. 8），1%Triton X-100（t-octylphenoxypolyethoxyethanol，辛基苯氧基聚乙氧乙醇），1 mg/mL BSA(bovine serum albumin 牛血清蛋白).5.14电泳缓冲液：Tris54 g，硼酸27.5 g.0.5 mol/L TE缓冲液（pH8 0)20 mL.加蒸馏水至1 000 mL; 使用时10倍稀释.5.15澳化乙锭贮存液：用水配制成10mg/ml.5.16加样缓冲液：0.25%澳酚蓝，40%（质量浓度）蔗糖水溶液.5. 17 酶切缓液;10 mmol/L Tris-HCI (pH7 5) 10 mmol/ L MgCl 50 mmol/L NaC1 0. 1 mg/mL BSA.
6仪器设备
6.1DNA热循环仪.6.2核酸蛋白分析仪或紫外分光光度计.6.3恒温水浴锅 6.4离心机：离心力12000g6.5微量移液器（0.5 μL~10pL，10 pl~100μL，10μL~200μL100pL~1 000pL).6.6电泳仪.6.7紫外检测仪.6.8pH计. 6.9天平：感量0.01g.
7试样选取与制备
按照GB/T14699.1采样，将实验室样品粉碎，充分混合均匀后待用.
8检验步骤
8.1样品的总DNA提取
称取样品于微量离心管中，加人600μL~800gL裂解液，65C3h，期间不时振荡混匀；12000g离淀1h；12000g离心5min，弃上清液：70%乙醇洗涤一次，晾干：加人50pLTE，溶解沉淀.2
GB/T 21106-2007
也可用等效DNA提取试剂盒提取模板DNA
8.2DNA浓度和纯度的测定
260nm和280nm处的吸光值A和Ag.DNA的浓度按式（1）计算： 取5uLDNA溶液加双蒸水稀释至1mL，使用核酸蛋白分析仪或紫外分光光度计分别检测
式中：
c-DNA浓度，单位为微克每微升（μg/μL）；
A-260nm处的吸光值；
N--核酸稀释倍数.
当A/A比值在1.7~1.9之间时，适宜于PCR扩增.
8.3PCR扩增
DNA聚合酶2U、模板 DNA 100 ng土50ng 50μL反应体系：10×PCR缓冲液5pL、dNTP （5mmol/L） 1μL、引物对（各5 pmol/L）2pL、Taq
一般反应程序：94C预变性5min，94C变性30s 63C退火30s 72C延伸30s.30个循环.72C延伸5min.4C保存.
检测过程中分别设阳性对照、阴性对照和空白对照.用已知含鹿源性成分的样品作阳性对照.用已知不含鹿源性成分的样品作阴性对照，用等体积的双蒸水代替模板DNA作空白对照.
8.4PCR扩增产物电泳检测
取2g琼脂糖，于100mL电泳缓冲液中加热，充分熔化，加入溴化乙锭贮存液至终浓度为0.5μg/ml.制胶.在电泳槽中加人电泳缓冲液，使液面刚刚没过凝胶.将5pL~8gLPCR扩增产物分别和适量加样缓冲液混合，点样.9V/cm恒压电泳，直至溴酚蓝指示剂迁移至凝胶中部.紫外检测仪下观察电泳结果并记录.
8.5限制性内切酶酶切及产物电泳检测
如果PCR扩增产物电泳检测结果阳性，进行限制性内切酶酶切反应.酶切在37C下进行，30min.酶切完成后电泳，方法见8.4.
9结果判断与表述
9.1PCR扩增产物电泳检测结果
9.2限制性内切酶酶切电泳检测结果
扩增产物酶切片段大小为145bp和49 bp.
9.3结果表述
PCR产物为阳性，同时酶切结果正确者判为含有鹿源性成分，表述为检出鹿源性成分；PCR产物为阴性者判为不含有鹿源性成分，表述为未检出鹿源性成分.
10检测过程中防止交叉污染的措施
按照SN/T 1193执行.
11康弃物处理
检测过程中的废弃物，收集后在焚烧炉中焚烧处理.
